Page: of 6 Human Reproduction Vol.

Trang: của 6 Human Reproduction Vol.21, No.11 pp. 2876–2881, 2006 doi:10.1093/humrep/del251 Advance Access publication June 22, 2006. 2876 © The Author 2006. Published by Oxford University Press on behalf of the European Society of Human Reproduction and Embryology. All rights reserved. For Permissions, please email: journals.permissions@oxfordjournals.org Sperm DNA fragmentation: paternal effect on early post-implantation embryo development in ART A.Borini1,4 , N.Tarozzi1, D.Bizzaro2 , M.A.Bonu1 , L.Fava1, C.Flamigni3 and G.Coticchio1 1 Tecnobios Procreazione, Centre for Reproductive Health, Via Dante 15, Bologna, 2Institute of Biology and Genetic, University Polytechnic of Marche, Via Brecce Bianche, Ancona and 3University of Bologna, Bologna, Italy 4To whom correspondence should be addressed at: Tecnobios Pr ocreazione, Centre for Reproductive Health, Via Dante 15, I-40125 Bologna, Italy. E-mail: borini@tecnobiosprocreazione.it BACKGROUND: The relationship between early embryo post-i mplantation development in couples undergoing assisted reproductive techniques (ARTs) and sperm chromatin alterations has not been satisfactorily explained. The aim of this study was to assess the relationship between sperm DNA fragmentation in IVF/ICSI patients, sperm parameters (concen-tration, motility and morphology) and ART outcome, especially with regard to clinical pregnancy and pregnancy loss (spontaneous miscarriage or biochemical pregnancy). METHODS: DNA fragmentation was evaluated by TUNEL assay, performed on sperm suspensions after density gradient separation, in 132 men undergoing an ART cycle (82 IVF and 50 ICSI) and correlated with sperm paramet ers and ART outcome. RESULTS: A highly significant negative correlation was found between DNA fragmentation and sperm parameters. There was a close relationship between DNA fragmentation and post-implantation development in ICSI patients: th e clinical pregnancy and pr egnancy loss rates signifi-cantly differed between patients with high and low sperm DNA fragmentation (P = 0.007 and P = 0.009, respec-tively). CONCLUSIONS: Sperm DNA fragmentation seems to affect embryo post-implantation development in ICSI procedures: high sperm DNA fragmentation can compromise ‘embryo viability’, resulting in pregnancy loss. Key words: abortion/ART/DNA fragmentation/human sperm/pregnancy Introduction Many studies have shown how a ‘paternal effect’ can cause repeated assisted reproductive technique (ART) failures (Vanderzwalmen et al ., 1991; Perinaud et al., 1993; Janny and Menezo, 1994; Hammadeh et al., 1996; Sanchez et al., 1996; Shoukir et al., 1998). Many authors have shown how this ‘paternal effect’ can be traced back to anomalies in sperm chromatin organization: the sperm of subfertile men are char-acterized by suscep tibility to acid-induced denaturation in situ (Spano et al ., 2000), reduced chromatin condensation (Bianchi et al., 1996), chromosomic anomalies (Moosani et al., 1995) and/or increased DNA strand breaks (Lopes et al ., 1998; Irvine et al., 2000). It has been shown how a high percentage of sper-matozoa with alterations in chromatin structure has a negative effect on ART procedure outcome (Sun et al., 1997; Lopes et al., 1998; Larson et al ., 2000; Morris et al ., 2002; Benchaib et al ., 2003). These studies have focused on testing for possible correlations between paternal chromatin alterations and fertili-zation, embryo cleavage, blastocyst development and clinical pregnancy rates, in both IVF and ICSI. These findings suggest that paternal genomic alterations may compromise not only fertilization and embryo quality but also ‘embryo viability’ and prog ression of pregnancy, resulting in spontaneous miscarriage or bi ochemical pregnancy. To date, a number of studies in men and animals have highlighted the importance of the ‘paternal factor ’, including male age or pater-nal exposure to toxic materials, in spontaneous miscarriages (Olshan and Faustman, 1993; Marchetti et al., 1999; Carrell and Liu, 2003; Carrell et al ., 2003; Hjollund et al ., 2005; Slama et al ., 2005), but the relationship between ‘early post-implantation embryo development’ in couples undergoing ART and sperm DNA integrity still remains to be explained. The effect of altered sperm chromatin integrity on post-embryonic develop-ment is therefore still a matter of debate (Larson et al., 2000). The aim of this study was to examine, in IVF and ICSI patients, the possible relationship between sperm DNA frag-mentation, assessed by TUNEL assay, traditional sperm evalu-ation parameters (concentration, motility and morphology) and ART outcome, especially in regard to clinical pregnancy and, as a new issue, pregnancy loss, the latter defined as spontane-ous miscarriage or biochemical pregnancy. Subjects and methods Patients The study was carried out at Tecnobios Procreazione, Bologna, Italy. A total of 132 couples undergoing an ART cycle were included: 50 cycles were ICSI and 82 IVF. The mean age of women included in the by guest on June 4, 2013 http://humrep.oxfordjournals.org/ Downloaded from Sperm DNA fragmentation and the post-implantation embryo 2877 study was 37.05 ± 4.19 years and the mean BMI was 22.17 ± 3.13 kg/ m2. The mean age of men was 40.24 ± 5.17 years. Only men with ejaculated sperm were included in the study. The indication for ICSI treatment was severe male factor (sperm concentration <10 × 106/ml and/or sperm motility <30% and/or nor-mal sperm morphology <4%). This was associated with oligo-ovula-tion in 1 couple (2%), endometriosis in 5 couples (10%) and tubal defects in 10 couples (20%); aetiology of infertility was only male factor in 27 couples (54%) and unexplained in 7 couples (14%). In IVF patients, the aetiology of infertility was oligo-ovulation in 2 cou-ples (2.4%), endometriosis in 14 couples (17.1%), unexplained in 17 couples (20.7%), tubal defects in 39 couples (47.6%) and male factor in 10 couples (12.2%). Sperm collection and preparation Sperm samples were collected by masturbation. Samples were ana-lysed following WHO indications (WHO, 1999) for total sperm number, concentration, motility and morphology and were prepared using a discontinuous PureSperm gradient (Nidacon, Gothemberg, Sweden). Briefly, sperm was layered upon a 40:80% PureSperm den-sity gradient, processed by centrifuge at 600 × g for 15 min and resus-pended in 1 ml of sperm culture medium (PureSperm wash, Nidacon, Gothemberg, Sweden). After density gradient separation, a second evaluation of concentration, motility and morphology was performed. Ovarian stimulation, IVF, IC SI and embryo development Ovarian stimulation was achieved by recombinant FSH (Gonal F, Serono, Rome, Italy; Puregon, Organon, Rome, Italy) and monitored by endovaginal echography and plasma estradiol. Thirty-six hours before oocyte retrieval, 10 000 IU of hCG (Gonasi, Amsa, Rome, Italy) was administered. Oocyte retrieval was carried out under gen-eral anaesthesia by a vaginal ultrasonography-guided aspiration. At 16–18 h after insemination or microinjection, as previously described (Borini et al., 2004a,b), oocytes were assessed for two PN presence. Forty-eight hours after oocyte retrieval, embryos were classified according to morphology and then transferred into the uterus. Clinical pregnancy was determined by ultrasound detection of gestational sac and biochemical pregnancy by th e presence of only one positive β-hCG measurement. DNA fragmentation analysis Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine tri-phosphate (dUTP) in situ DNA nick end labelling (TUNEL) assay was performed on sperm suspension after density gradient separation as previously described by Benchaib et al. (2003). Briefly, part of the sperm sample was used for oocyte insemination, whereas the other part of semen suspension was washed in phosphate-buffered saline (PBS) (Sigma-Aldrich, Milan, Italy), smeared onto microscope slides, fixed in 4% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) in PBS for 30 min at 4°C and permeabilized with 0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium cit-rate (Sigma-Aldrich). Strand breaks in DNA were detected by TUNEL using a commercially available kit ( In situ Cell Death Detec-tion Kit, Fluorescein, Roche, Monza, Italy) according to the manufac-turer’s instructions. A negative control was performed for each sample by using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labelled dUTP without enzyme. The percentage of spermatozoa with fragmented DNA was determined by direct observation of 500 spermatozoa per sample with an epifluorescence microscope (NIKON eclipse 80i, Florence, Italy). IVF patients were divided in two groups: group A (n = 69), low TUNEL patients (TUNEL positivity <10%); group B (n = 13), high TUNEL patients (TUNEL positivity ≥10%). ICSI patients were also divided in two groups: group C (n = 20), low TUNEL patients (TUNEL positivity <10%); group D (n = 30), high TUNEL patients (TUNEL positivity ≥10%). The threshold value of 10% was chosen in line with the previous study of Benchaib et al . (2003) performed using the same technique for sperm prepar ation (density gradient separation with PureSperm) and for detection of DNA damage on the sperm sus-pension obtained in this manner (TUNEL assay and evaluation of pos-itive sperms with epifluorescence microscope). Outcome definitions and statistical analysis (i) Clinical pregnancy rate was defined as the number of patients with fetal heartbeat divided by the number of treatments; (ii) Biochemical pregnancy rate was the number of biochemical pregnancies divided by the number of β-HCG positive patients; (iii) Spontaneous miscarriage rate was the number of spontaneous miscarriages divided by the number of β-HCG positive patients; (iv) Pregnancy loss rate was the number of biochemical pregnan-cies and spontaneous miscarriages divided by the number of β-HCG positive patients; (v) TUNEL positivity rate was the number of patients with DNA fragmentation >10% divided by the number

Page: 6
Human Reproduction Vol.21, số 11 pp 2876-2881, 2006 doi:. 10,1093 / humrep / del251 ấn cận tiên tiến June 22, 2006. 2876 © 2006. Tác giả Nhà xuất bản Oxford University Press thay mặt cho Hiệp hội Phôi học và sinh sản người châu Âu. Tất cả quyền được bảo lưu. Cho phép, xin vui lòng gửi email: journals.permissions@oxfordjournals.org phân mảnh DNA tinh trùng: có tác dụng phụ tử trên phát triển của phôi sau cấy sớm ART A.Borini1,4, N.Tarozzi1, D.Bizzaro2, MABonu1, L.Fava1, C. Flamigni3 và G.Coticchio1 1 Tecnobios Procreazione, Trung tâm sức khỏe sinh sản, Via Dante 15, Bologna, 2Institute Sinh học và Di truyền, Trường Đại học Bách khoa Marche, Via Brecce Bianche, Ancona và 3University của Bologna, Bologna, Italy 4to người thư nên được giải quyết tại: Tecnobios Pr ocreazione, Trung tâm Sức khỏe sinh sản, Via Dante 15, I-40.125 Bologna, Italy. E-mail: BỐI CẢNH borini@tecnobiosprocreazione.it: Mối quan hệ giữa phôi ban đầu sau i mplantation phát triển ở các cặp vợ chồng trải qua các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (nghệ thuật) và các biến đổi nhiễm sắc thể của tinh trùng chưa được giải thích thỏa đáng. Mục đích của nghiên cứu này là để đánh giá mối quan hệ giữa sự phân mảnh DNA tinh trùng ở bệnh nhân IVF / ICSI, các thông số tinh trùng (gồm tập trung vào-nồng, sự vận động và hình thái) và kết cục ART, đặc biệt là đối với các thai lâm sàng và sẩy thai (sẩy thai tự nhiên hay mang thai sinh hóa với ). Phương pháp: phân mảnh DNA được đánh giá bởi tunel khảo nghiệm, thực hiện trên hệ thống treo tinh trùng sau khi mật độ dốc tách, trong 132 người đàn ông trải qua một chu kỳ ART (82 IVF và 50 ICSI) và tương quan với ers paramet tinh trùng và kết quả điều trị ARV. KẾT QUẢ: Có sự tương quan tiêu cực rất quan trọng được tìm thấy giữa các mảnh DNA và các thông số tinh trùng. Có một mối quan hệ chặt chẽ giữa các mảnh DNA và sự phát triển sau cấy ghép ở những bệnh nhân ICSI: thứ e mang thai và pr egnancy lệ tổn thất lâm sàng signifi-đáng khác nhau giữa các bệnh nhân có tinh trùng cao và thấp phân mảnh DNA (P = 0,007 và P = 0,009, respec- cực). Kết luận: Tinh trùng DNA phân mảnh dường như ảnh hưởng đến phôi thai phát triển sau cấy trong thủ tục ICSI: tinh trùng cao DNA phân mảnh có thể thỏa hiệp 'phôi khả năng tồn tại ", dẫn đến sẩy thai. Từ khóa: phá thai / ART / DNA phân mảnh / con người tinh trùng / Giới thiệu mang thai Nhiều nghiên cứu đã cho thấy làm thế nào một "hiệu ứng nội 'có thể gây ra lặp đi lặp lại hỗ trợ kỹ thuật sinh sản (ART) thất bại (Vanderzwalmen et al 1991,; Perinaud et al, 1993;.. Janny và Menezo, 1994;. Hammadeh et al, 1996;. Sanchez et al, 1996; Shoukir et al, 1998).. Nhiều tác giả đã chỉ ra cách thức mà "tác dụng phụ tử 'có thể được truy trở lại bất thường trong các tổ chức nhiễm sắc tinh trùng: tinh trùng của người đàn ông subfertile là char-trưng bởi tibility suscep để biến tính axit gây ra tại chỗ, giảm (Spano et al., 2000) ngưng tụ chất nhiễm sắc, dị thường chromosomic (Moosani et al., 1995) và / hoặc tăng phá vỡ sợi DNA (Bianchi et al., 1996) (Lopes et al 1998,;. Irvine et al., 2000). Nó đã được chứng minh làm thế nào một tỷ lệ phần trăm cao của sper-matozoa với sự thay đổi trong cấu trúc nhiễm sắc thể có một ảnh hưởng tiêu cực đến kết quả thủ tục ART (Sun et al 1997,;. Lopes et al 1998,;. Larson et al, 2000;. Morris et al ., 2002; Benchaib et al, 2003).. Những nghiên cứu đã tập trung vào thử nghiệm cho mối tương quan có thể có giữa các thay đổi nội chromatin và fertili-tổ, giai đoạn phân chia, phát triển phôi và tỷ lệ thai lâm sàng, trong cả hai IVF và ICSI. Những phát hiện này cho thấy sự biến đổi gen của cha có thể thỏa hiệp không chỉ thụ tinh và phôi chất lượng mà còn "phôi khả năng tồn tại và ăn xin ression của thai kỳ, dẫn đến sảy thai tự nhiên hoặc bi mang thai ochemical. Đến nay, một số nghiên cứu ở người và động vật đã nêu bật tầm quan trọng của "yếu tố nội ', bao gồm tuổi nam hay Pater-nal tiếp xúc với các chất độc hại, trong trường hợp sẩy thai tự phát (Olshan và Faustman năm 1993;. Marchetti et al, 1999 ; Carrell và Liu, 2003; Carrell et al, 2003;. Hjollund et al, 2005;.. SLAMA et al, 2005), nhưng mối quan hệ giữa 'sớm sau cấy phôi phát triển "trong các cặp vợ chồng trải qua ART và DNA tinh trùng vẫn vẹn vẫn còn để được giải thích. Do đó, tác động của biến đổi nhiễm sắc vẹn tinh trùng vào hậu phôi thai phát triển-ment là vẫn còn là một vấn đề của cuộc tranh luận (Larson et al., 2000). Mục đích của nghiên cứu này là để kiểm tra, trong IVF và ICSI bệnh nhân, các mối quan hệ có thể có giữa DNA tinh trùng frag-việc triển, đánh giá của tunel khảo nghiệm, evalu-ation tinh trùng truyền thống các thông số (nồng độ, sự vận động và hình thái) và kết cục ART, đặc biệt là trong vấn đề để thai lâm sàng và, như là một vấn đề mới, sẩy thai, sau này được xác định như sẩy thai hoặc sinh hóa mang thai spontane-độc hại. Nghiên cứu Đối tượng và phương pháp Bệnh nhân đã được thực hiện tại Tecnobios Procreazione, Bologna, Italy. Tổng cộng có 132 cặp vợ chồng trải qua một chu kỳ ART đã được bao gồm: 50 chu kỳ là ICSI và 82 IVF. Tuổi trung bình của phụ nữ bao gồm trong bởi khách vào ngày 04 Tháng Sáu 2013 http://humrep.oxfordjournals.org/ Tải về từ
tinh trùng phân mảnh DNA và sau cấy phôi 2877 nghiên cứu là 37,05 ± 4,19 năm và BMI trung bình là 22,17 ± 3.13 kg / m2. Tuổi trung bình của nam giới là 40,24 ± 5,17 năm. Chỉ có những người đàn ông có tinh trùng xuất tinh được đưa vào nghiên cứu. Các chỉ định điều trị ICSI là yếu tố đực nặng (nồng độ tinh trùng <10 × 106 / ml và / hoặc nhu động tinh trùng <30% và / hoặc không-mal hình thái tinh trùng <4%). Điều này đã được liên kết với oligo-ovula-tion trong 1 cặp (2%), lạc nội mạc tử trong 5 cặp vợ chồng (10%) và các khuyết tật ống dẫn trứng trong 10 cặp vợ chồng (20%); nguyên nhân của vô sinh là yếu tố duy nhất của nam giới trong 27 cặp vợ chồng (54%) và giải thích được trong 7 cặp vợ chồng (14%). Ở những bệnh nhân IVF, nguyên nhân của vô sinh là oligo-rụng trứng trong 2 cou-ples (2,4%), lạc nội mạc tử trong 14 cặp vợ chồng (17,1%), không giải thích được trong 17 cặp vợ chồng (20,7%), khiếm khuyết ống dẫn trứng trong 39 cặp vợ chồng (47,6%) và Yếu tố nam trong 10 cặp vợ chồng (12,2%). Bộ sưu tập tinh trùng và chuẩn bị tinh trùng mẫu được thu thập bằng cách thủ dâm. Các mẫu được ana-li giải WHO chỉ (WHO, 1999) cho tổng số lượng tinh trùng, nồng độ, sự vận động và hình thái học và đã được chuẩn bị bằng cách sử dụng một PureSperm dốc liên tục (Nidacon, Gothemberg, Thụy Điển) sau đây. Tóm lại, tinh trùng đã được xếp lớp trên một 40: 80% PureSperm den-sự đa gradient, xử lý bằng máy ly tâm tại 600 × g trong 15 phút và resus-pended trong 1 ml môi trường nuôi cấy tinh trùng (rửa PureSperm, Nidacon, Gothemberg, Thụy Điển). Sau khi mật độ tách gradient, một đánh giá thứ hai tập trung, khả năng vận động và hình thái học đã được thực hiện. Kích thích buồng trứng, thụ tinh ống nghiệm, IC SI và phát triển của phôi kích thích buồng trứng đã đạt được bằng cách tái tổ hợp FSH (Gonal F, Serono, Rome, Italy; Puregon, Organon, Rome, Ý), theo dõi bằng siêu âm endovaginal và estradiol trong huyết tương. Ba mươi sáu giờ trước khi lấy tế bào trứng, 10 000 IU hCG (Gonasi, Amsa, Rome, Ý) được quản lý. Hồi tế bào trứng được thực hiện dưới gây mê gen-Eral bởi một siêu âm dẫn đường khát vọng âm đạo. Tại 16-18 giờ sau khi thụ tinh hoặc tiêm, như được mô tả trước đây (Borini et al., 2004a, b), tế bào trứng được đánh giá về hai mặt PN. Bốn mươi tám giờ sau khi lấy tế bào trứng, phôi được phân loại theo hình thái và sau đó được chuyển vào tử cung. Thai lâm sàng được xác định bằng siêu âm phát hiện của túi thai và mang thai sinh hóa của e hiện diện thứ chỉ một tích cực đo β-hCG. Phân mảnh DNA ga phân tích deoxynucleotidyl transferase qua trung gian deoxyuridine tri-phosphate (dUTP) về nhãn cuối DNA nick situ (tunel) khảo nghiệm được thực hiện trên hệ thống treo tinh trùng sau khi mật độ tách gradient như mô tả trước đây bởi Benchaib et al. (2003). Tóm lại, một phần của mẫu tinh trùng đã được sử dụng cho các tế bào trứng thụ tinh, trong khi các phần khác của hệ thống treo tinh dịch đã được rửa sạch trong đệm phosphat mặn (PBS) (Sigma-Aldrich, Milan, Italy), bôi lên lam kính, cố định trong 4% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) trong PBS trong 30 phút ở nhiệt độ 4 ° C và permeabilized với 0,1% Triton X-100 0.1% sodium cit-rate (Sigma-Aldrich). Phá vỡ sợi trong DNA được phát hiện bằng cách sử dụng một bộ tunel thương mại có sẵn (In situ di Chết Detec-tion Kit, fluorescein, Roche, Monza, Italy) theo hướng dẫn của manufac-turer của. Một kiểm soát tiêu cực đã được thực hiện cho mỗi mẫu bằng cách sử dụng isothiocyanate fluorescein (FITC) -labelled dUTP mà không enzyme. Tỷ lệ tinh trùng với DNA bị phân mảnh đã được xác định bằng cách quan sát trực tiếp của 500 tinh trùng mỗi mẫu bằng kính hiển vi epifluorescence (NIKON eclipse 80i, Florence, Italy). Bệnh nhân IVF được chia thành hai nhóm: nhóm A (n = 69), bệnh nhân tunel thấp (tunel dương <10%); nhóm B (n = 13), bệnh nhân tunel cao (tunel dương ≥10%). Bệnh nhân ICSI cũng được chia thành hai nhóm: nhóm C (n = 20), bệnh nhân tunel thấp (tunel dương <10%); nhóm D (n = 30), bệnh nhân tunel cao (tunel dương ≥10%). Các giá trị ngưỡng 10% đã được lựa chọn phù hợp với các nghiên cứu trước đây của Benchaib et al. (2003) thực hiện bằng cách sử dụng kỹ thuật tương tự cho tinh trùng ation trình chuẩn bị (mật độ tách gradient với PureSperm) và để phát hiện các tổn thương DNA trên tinh trùng sus-lương hưu thu được theo cách này (tunel khảo nghiệm và đánh giá tinh pos-dương tính với epifluorescence kính hiển vi). Định nghĩa kết quả và phân tích thống kê (i) tỷ lệ có thai lâm sàng được định nghĩa là số lượng bệnh nhân có nhịp tim của thai nhi được chia cho số lần điều trị; (Ii) tỷ lệ mang thai Sinh hóa là số lần mang thai sinh hóa chia cho số lượng bệnh nhân β-HCG tích cực; (Iii) tỷ lệ sẩy thai tự phát là số lượng các trường hợp sẩy thai tự phát chia cho số lượng bệnh nhân β-HCG tích cực; (Iv) tỷ lệ tổn thất trong thai là số sinh hóa pregnan-những chính và sẩy thai tự phát chia cho số lượng bệnh nhân β-HCG tích cực; (V) tỷ lệ tunel dương là số lượng các bệnh nhân với phân mảnh DNA> 10% chia cho số