2.6. Construction of plasmids conta

2.6. Construction of plasmids containing target sequences

PCR amplicons for all target loci were produced using the RT real-time PCR procedure without probe. Amplicons were cloned into pCR 2.1-TOPO (Invitrogen applied biosystems, UK), following the manufacturers guidelines. Plasmid DNA, with cloned target DNA sequences, was purified, and concentrations were calculated using a NanoDrop spectrophotometer (Thermo- Scientific, UK). DNA concentrations were converted to copy
number using the formula: mol/g × molecules/mol = molecules/g,
via a DNA copy number calculator (http://www.uri.edu/research/
gsc/resources/cndna.html). Ten-fold serial dilutions of plasmid DNA containing the cloned target insert were used as an external standard for all quantitative one-step Real-time RT PCR experi- ments.

2.7. Detection limits and amplification interpretation

Ten-fold serial dilutions of plasmid DNA containing the cloned target insert, with concentrations ranging from 5 × 100 to 5 × 103
copies per reaction, were amplified on five consecutive days. Ten replicates were performed daily. The detection limit was calculated using fifty individual Cp values and set at the target DNA concen- tration at which a positive PCR signal was produced in 95% or more of the samples tested.
Accurate DNA extraction and amplification was confirmed by the production of a signal from the EAV internal control. A negative PCR result was concluded if negative controls were negative, if the internal control showed the predicted Cp value, and if a reporter signal for target sequences could not be detected (Cp > 40). Data was deemed non-interpretable when the negative control demon- strated contamination and/or the internal control did not yield a sufficient Cp value.

2.8. Reproducibility, linearity and efficiency

The co-efficient of variance (CV%) was calculated by assessing the Cp value deviation of selected plasmid DNA concentrations across multiple amplifications. Intra-assay reproducibility was determined by comparing the Cp values generated in the same run of four replicates over each plasmid concentration. Inter-assay reproducibility was assessed by comparing the Cp values gener- ated by four replicates of each plasmid concentration each day over a period of four days. Linearity was assessed from the Cp values of 10-fold serial dilutions of plasmid DNA containing cloned tar-
get sequences (concentrations 5 × 100 to 5 × 108 ) and calculating

their linear regression. Efficiency was calculated from the slope of the standard curve using the formula: Efficiency = 10(−1/slope) −1,
according to the methods of Rasmussen (2001).
Data were exported into Microsoft Excel (Microsoft, USA), and analyzed using STATA 9.2 (StataCorp, College Station TX, USA); spe- cific statistical tests used are outlined in the results.

3. Results

3.1. Analytical specificity and detection limits

Two one-step RT real-time PCR assays were developed. One PCR contained primers and probes detecting RoV, NoVII and EAV, the other contained primers and probes to detect NoVI and EAV. Plasmid DNA containing RoV, NoVI and NoVII target sequences were used as positive amplification controls. Both PCR assays were tested on nucleic acid extracted from 45 gastrointestinal organisms, including enterovirus, Escherichia coli, Campylobacter, Shigella spp., Salmonella spp. and Klebsiella spp. Neither assay demonstrated any nonspecific amplification with any target nucleic acid from any of the organisms tested. The NoVI, NoVII and RoV Cp values obtained during multiplex PCR remained unchanged from mono- amplification at the same concentration. The detection limits of the assays were 500, 5 and 50 copies of the cloned target sequence for RoV, NoVII and NoVI, respectively.

3.2. Reproducibility and linearity

Table 2 shows the results from a series of consecutive standard curve experiments. These data demonstrate overall performance, intra-assay variation and inter-assay variation of the PCRs. The intra-assay CV and the inter-assay CV across the three targets ranged from 0.2% to 4.07% and 0.5% to 5.22%, respectively, with
target copy numbers from 5 × 100 to 5 × 108 copies per reaction.
Linearity was assessed by Cp values generated from amplifica-
tion of eight ten-fold serial dilutions. The linear regressions of the three standard curves were R2 = 0.992 for RoV, R2 = 0.992 for NoVI and R2 = 0.999 for NoVII, indicating a significant linear correlation between Cp value and amount of nucleic acid over a range of con- centrations. The efficiencies of the amplifications were 94% for RoV (95% CI; 93–98%), 89% for NoVI (95% CI; 87–91%) and 96% for NovII (95% CI; 94–98%).

3.3. Comparison of EIAs and one-step RT real-time PCRs

The performance and sensitivity of the PCR assays were evaluated against EIA (Table 3). Sensitivity was compared using ten-fold dilutions off three RoV EIA+/PCR+ samples and three NoV EIA+/PCR+ samples. For the RoV positive samples, all were

Kết quả (Việt) 1:

2.6. xây dựng một plasmid có mục tiêu trình tựĐảng Cộng sản Romania amplicons cho tất cả mục tiêu loci được sản xuất bằng cách sử dụng các thủ tục RT Đảng Cộng sản Romania thời gian thực mà không có thăm dò. Amplicons đã được nhân bản thành Đảng Cộng sản Romania 2.1-TOPO (Invitrogen áp dụng biosystems, UK), theo các hướng dẫn của nhà sản xuất. Plasmid DNA, với mục tiêu nhân bản trình tự ADN, là purified, và nồng độ được tính toán bằng cách sử dụng một NanoDrop phối (nhiệt-Scientific, Vương Quốc Anh). Nồng độ DNA được cải biến để sao chépsố bằng cách sử dụng công thức: mol/g × phân tử/mol = phân tử/g,thông qua một DNA bản sao số máy tính (http://www.uri.edu/research/GSC/Resources/cndna.html). Ten-Fold dilutions nối tiếp của plasmid DNA có chèn mục tiêu nhân bản đã được sử dụng như là một tiêu chuẩn bên ngoài cho tất cả One-bước định lượng thời gian thực RT PCR experi-ments.2.7. phát hiện giới hạn và amplification giải thíchTen-Fold dilutions nối tiếp của plasmid DNA có mục tiêu nhân bản chèn, với nồng độ khác nhau, từ 5 × 100 để 5 × 103bản sao một phản ứng, đã là amplified trên five ngày liên tiếp. Mười sao chép được thực hiện hàng ngày. Giới hạn phát hiện đã được tính toán bằng cách sử dụng giá trị Cp cá nhân fifty và đặt mục tiêu DNA concen-tration mà tại đó một tín hiệu tích cực của Đảng Cộng sản Romania được sản xuất với 95% hoặc nhiều hơn các mẫu thử nghiệm.Chính xác các DNA khai thác và amplification là confirmed bởi sản xuất một tín hiệu từ EAV kiểm soát nội bộ. Một kết quả tiêu cực của Đảng Cộng sản Romania đã được ký kết nếu tiêu cực điều khiển đã được tiêu cực, nếu kiểm soát nội bộ cho thấy giá trị Cp dự đoán, và nếu một tín hiệu phóng viên cho mục tiêu trình tự không thể được phát hiện (Cp > 40). Dữ liệu được coi là phòng không interpretable khi ô nhiễm quỷ-strated kiểm soát tiêu cực và/hoặc kiểm soát nội bộ đã không mang lại một sufficient Cp giá trị.2.8. reproducibility, linearity và efficiencyCo-efficient của phương sai (CV %) đã được tính toán bằng cách đánh giá độ lệch giá trị Cp đã chọn plasmid DNA nồng độ trên nhiều amplifications. Intra-khảo nghiệm reproducibility đã được xác định bằng cách so sánh các giá trị Cp được tạo ra trong cùng một chạy bốn sao chép trên mỗi tập trung plasmid. Khảo nghiệm liên reproducibility được đánh giá bằng cách so sánh giá trị Cp gener-ated bởi bốn sao chép của mỗi tập trung plasmid mỗi ngày trong một khoảng thời gian bốn ngày. Linearity đánh giá từ các giá trị Cp của 10-fold dilutions nối tiếp của plasmid DNA có nhân bản tar-có được chuỗi (nồng độ 5 × 100 để 5 × 108) và tính toán của hồi quy tuyến tính. Efficiency đã được tính toán từ độ dốc của đường cong tiêu chuẩn bằng cách sử dụng công thức: Efficiency = 10(−1/slope) −1,theo phương pháp Rasmussen (2001).Dữ liệu đã được xuất khẩu vào Microsoft Excel (Microsoft, Hoa Kỳ), và phân tích bằng cách sử dụng STATA 9.2 (StataCorp, TX College Station, Mỹ); SPE-cific bài kiểm tra thống kê sử dụng được trình bày trong các kết quả.3. kết quả3.1. phân tích các giới hạn specificity và phát hiệnHai One-Bước assays nòng RT Đảng Cộng sản Romania thời gian thực được phát triển. Một đảng Cộng sản Romania chứa chất nền, mồi và đầu dò phát hiện RoV, NoVII và EAV, khác chứa chất nền, mồi và đầu dò để phát hiện NoVI và EAV. Plasmid DNA có RoV, NoVI và NoVII mục tiêu trình tự đã được sử dụng như là tích cực amplification điều khiển. Cả hai thử nghiệm Đảng Cộng sản Romania đã được thử nghiệm trên axit nucleic được chiết xuất từ 45 sinh vật tiêu hóa, bao gồm cả enterovirus, Escherichia coli, Campylobacter Shigella spp., Salmonella spp. và Klebsiella spp. Khảo nghiệm không chứng minh bất kỳ amplification nonspecific với bất kỳ mục tiêu nucleic acid từ bất kỳ sinh vật được thử nghiệm. NoVI, NoVII và RoV Cp giá trị thu được trong Đảng Cộng sản Romania multiplex vẫn không thay đổi từ mono-amplification lúc tập trung cùng một. Các giới hạn phát hiện của các thử nghiệm là 500, 5 và 50 bản sao của chuỗi nhân bản mục tiêu cho RoV, NoVII và NoVI, tương ứng.3.2. reproducibility và linearityBảng 2 cho thấy các kết quả từ một loạt các thí nghiệm liên tiếp đường cong tiêu chuẩn. Những dữ liệu này chứng minh hiệu suất tổng thể, intra-khảo nghiệm biến thể và liên khảo nghiệm biến thể của các PCRs. CV intra-khảo nghiệm và CV liên khảo nghiệm trên các mục tiêu ba trải dài từ 0,2% đến 4,07% và 0,5% đến 5,22%, tương ứng, vớimục tiêu bản sao số từ 5 × 100 đến 5 × 108 sao cho một phản ứng.Linearity được đánh giá bởi Cp giá trị được tạo ra từ amplifica-tion của tám ten-fold nối tiếp dilutions. Regressions tuyến tính của các đường cong tiêu chuẩn ba là R2 = 0.992 cho RoV, R2 = 0.992 NoVI và R2 = 0,999 cho NoVII, cho thấy một sự tương quan significant tuyến tính giữa Cp giá trị và số lượng axit nucleic trên một phạm vi của con-centrations. Efficiencies các amplifications là 94% cho RoV (95% CI; 93-98%), 89% cho NoVI (95% CI; 87-91%) và 96% cho NovII (95% CI; 94-98%).3.3. so sánh các EIAs và One-Bước RT thời gian thực PCRsHiệu suất và sự nhạy cảm của Đảng Cộng sản Romania thử nghiệm đã được đánh giá chống lại dự án (bảng 3). Nhạy cảm được so sánh bằng cách sử dụng ten-fold dilutions ra ba RoV dự án +/ PCR + mẫu và ba tháng mười một dự án +/ PCR + mẫu. Cho các mẫu RoV tích cực, tất cả đều

Kết quả (Việt) 2:

2.6. Xây dựng các plasmid có chứa mục tiêu trình tự amplicon PCR cho tất cả các locus mục tiêu đã được sản xuất bằng cách sử dụng thủ tục PCR RT thời gian thực mà không cần thăm dò. Amplicon được nhân bản vô tính thành PCR 2.1-TOPO (Invitrogen áp dụng hệ thống sinh học, Vương quốc Anh), theo hướng dẫn nhà sản xuất. Plasmid DNA, với trình tự DNA mục tiêu nhân bản, là puri fi ed, và nồng độ được tính toán bằng cách sử dụng một máy quang phổ NanoDrop (Nhiệt khoa học fi c, Vương quốc Anh). Nồng độ DNA đã được chuyển đổi để sao chép số lượng bằng cách sử dụng công thức: mol / g × phân tử / mol = phân tử / g, thông qua một bản sao DNA số máy tính (http://www.uri.edu/research/ GSC / tài nguyên / cndna.html) . Pha loãng serial gấp mười lần của DNA plasmid có chứa các mục tiêu nhân bản chèn được sử dụng như một tiêu chuẩn bên ngoài cho tất cả các định lượng một bước Real-time RT PCR nghiệm ments. 2.7. Giới hạn phát hiện và fi ampli giải cation pha loãng serial Mười lần của DNA plasmid có chứa các mục tiêu chèn nhân bản, với nồng độ khác nhau, từ 5 × 100-5 × 103 bản sao cho mỗi phản ứng, là ampli fi ed trên fi ve ngày liên tiếp. Mười lần lặp lại được thực hiện hàng ngày. Giới hạn phát hiện đã được tính toán bằng cách sử dụng các giá trị Cp fi fty riêng và đặt tại các DNA mục tiêu nồng nồng mà một tín hiệu PCR dương tính được sản xuất trong 95% hoặc nhiều hơn các mẫu thử nghiệm. khai thác chính xác DNA và ampli fi cation được fi con rmed bởi việc sản xuất của một tín hiệu từ kiểm soát nội bộ EAV. Một kết quả PCR âm tính đã được kết luận nếu điều khiển âm đều âm tính, nếu kiểm soát nội bộ cho thấy giá trị Cp dự đoán, và nếu một tín hiệu báo cho các trình tự mục tiêu không thể được phát hiện (Cp> 40). Dữ liệu được cho là không thể phiên dịch khi kiểm soát tiêu cực demon- strated ô nhiễm và / hoặc kiểm soát nội bộ đã không mang lại một giá trị rừng đặc dụng fi cient Cp. 2.8. Độ lặp lại, tuyến tính và ef fi ciency Các đồng ef fi cient phương sai (CV%) đã được tính toán bằng cách đánh giá các giá trị độ lệch Cp của nồng độ DNA plasmid được lựa chọn trên nhiều cation fi ampli. Intra-xét nghiệm lặp lại được xác định bằng cách so sánh các giá trị Cp tạo ra trong thời gian cùng bốn lần nhắc lại trên mỗi nồng độ plasmid. Liên nghiệm lặp lại được đánh giá bằng cách so sánh các giá trị Cp nhìn chung ated bốn lần lặp lại của mỗi nồng độ plasmid mỗi ngày trong khoảng thời gian bốn ngày. Độ tuyến tính được đánh giá từ các giá trị Cp pha loãng nối tiếp 10 lần của DNA plasmid có chứa nhân bản mục tiêu hàng có được trình tự (nồng độ 5 × 100-5 × 108) và tính toán hồi quy tuyến tính của họ. Ef fi ciency đã được tính toán từ độ dốc của đường cong chuẩn bằng cách sử dụng công thức: Ef fi ciency = 10 (-1 / dốc) -1, theo các phương pháp của Rasmussen (2001). Dữ liệu được xuất khẩu sang Microsoft Excel (Microsoft, USA), và phân tích sử dụng STATA 9.2 (StataCorp, College Station TX, USA); biệt ci fi c kiểm tra thống kê sử dụng được nêu trong kết quả. 3. Kết quả 3.1. Giới hạn thành phố fi và phát hiện phân tích Speci Hai một bước RT xét nghiệm PCR thời gian thực được phát triển. Một PCR chứa mồi và đầu dò phát hiện RoV, Novii và EAV, mồi chứa khác và đầu dò để phát hiện Novi và EAV. DNA plasmid có chứa RoV, Novi và trình tự mục tiêu Novii đã được sử dụng như điều khiển fi cation ampli tích cực. Cả hai xét nghiệm PCR đã được thử nghiệm trên acid nucleic chiết xuất từ 45 sinh vật đường ruột, bao gồm enterovirus, Escherichia coli, Campylobacter, Shigella spp., Salmonella spp. và Klebsiella spp. Không xét nghiệm chứng minh bất kỳ nonspeci fi c ampli fi cation với bất kỳ acid nucleic mục tiêu từ bất kỳ của các sinh vật thử nghiệm. Novi, Novii và RoV Cp giá trị thu được trong quá trình multiplex PCR vẫn không thay đổi từ mono ampli fi cation ở cùng nồng độ. Các giới hạn phát hiện của xét nghiệm là 500, 5 và 50 bản sao của chuỗi mục tiêu nhân bản cho RoV, Novii và Novi, tương ứng. 3.2. Độ lặp lại và tuyến tính Bảng 2 cho thấy các kết quả từ một loạt các thí nghiệm đường cong tiêu chuẩn liên tiếp. Những dữ liệu chứng minh hiệu suất tổng thể, biến thể nội khảo nghiệm và liên khảo nghiệm biến thể của PCR. Các CV nội khảo nghiệm và các CV liên khảo nghiệm trên ba mục tiêu dao động từ 0,2% đến 4,07% và 0,5% đến 5,22%, tương ứng với số bản sao mục tiêu từ 5 × 100-5 × 108 bản sao cho mỗi phản ứng. Độ tuyến tính được đánh giá bởi giá trị Cp tạo ra từ ampli fi ca- sự tám mười lần pha loãng nối tiếp. Các hồi quy tuyến tính của ba đường cong chuẩn là R2 = 0,992 cho RoV, R2 = 0,992 cho Novi và R2 = 0,999 cho Novii, cho thấy một mối tương quan tuyến tính trong yếu không thể giữa giá trị Cp và lượng axit nucleic trong một phạm vi nồng. Các thiếu sót ef fi của cation fi ampli là 94% cho RoV (CI 95%; 93-98%), 89% cho Novi (CI 95%; 87-91%) và 96% cho Novii (CI 95%; 94-98%) . 3.3. So sánh EIA và một bước RT PCR thời gian thực Hiệu suất và độ nhạy của xét nghiệm PCR được đánh giá theo EIA (Bảng 3). Độ nhạy nào so sánh bằng cách sử dụng dung dịch pha loãng gấp mười lần off ba RoV EIA + / PCR + mẫu và ba Nov EIA + / PCR + mẫu. Đối với các mẫu RoV tích cực, tất cả đều