PCR+/EIA+ at the 10−1 dilution and

PCR+/EIA+ at the 10−1 dilution and all were PCR+/EIA− at the
10−3 dilution. For the NoVII positive samples, all were PCR+/EIA−
at the 10−3 dilution. Nucleic acid from RoV PCR+ and NoV PCR+
samples were combined on ten occasions to assess potential amplification inhibition induced by cross-reactivity. The Cp values were unchanged in samples containing RoV and NoV from those containing only RoV or NoV.
Ninety-four stool samples from patients with diarrhea and 94 stool samples from patients without diarrhea were investigated by EIA and PCR for RoV and NoV (Table 4). The EIA+ results corresponded precisely with qualitative PCR results for RoV and NoVI/II. In the children with diarrhea, 10/94 (10.6%) samples were
PCR+/EIA− for RoV and 22/94 (23.4%) were PCR+/EIA− for NoV.
In the children without diarrhea, 0/94 samples were PCR+/EIA−
for RoV and 7/94 (7.4%) samples were PCR+/EIA− for NoV. The
RoV PCR+/EIA+ Cp values samples were compared with the RoV PCR+/EIA− Cp values. The median Cp value from the RoV PCR+/EIA+ samples was 15.3; the median Cp value from the RoV PCR+/EIA−
samples was significantly higher at 22.5 (p < 0.0001; two-tailed t- test). The presence of RoV and NoV in the PCR+/EIA− samples was
confirmed by PCR amplification of the VP7 and VP4 genes in the RoV+ samples and VP1 in the NoV+ samples (Yan et al., 2003; Gomara et al., 2001). All produced the expected amplifications. Sequencing of the resulting amplicons confirmed the real-time RT PCR results, demonstrating these samples contained either GI RoV or GII.4 NoV, respectively (data not shown).


3.4. Quantitative PCR results

The PCRs were used to assess prevalence and quantitate NoV and RoV in stool samples from 217 children with diarrhea and 277 without diarrhea (including the 94 samples used to assess PCR sen- sitivity against EIA) (Fig. 1). From the samples from children with diarrhea, 101/217 (46.5%) were positive for RoV, 113/217 (52%) were positive for NoVII, 22/217 (10.1%) were positive for both RoV and NoVII and 0/217 were positive for NoVI. From the samples from children without diarrhea, 12/277 (4.3%) were positive for RoV,
25/277 (9%) were positive for NoVII and 5/277 (1.8%) were positive for NoVI.
Cp values were converted to copy number by use of a standard curve. The RoV loads in the samples from children with diarrhea were significantly higher than in the samples from children with- out diarrhea (with diarrhea; median = 10.06 log/RNA copies/ml (range; 5.56–12.49), without diarrhea; median = 8.33 log/RNA copies/ml (range; 5.43–10.52), p < 0.001, two tailed t-test) (Fig. 1). NoVII loads in the samples from children with diarrhea were significantly higher than in the samples from children without

diarrhea (with diarrhea; median = 6.85 log/RNA copies/ml (range;
2.89–9.71), without diarrhea; median = 5.07 log/RNA copies/ml (range; 3.63–9.16), p = 0.02, two tailed t-test). Only samples from children without diarrhea tested positive for NoVI, with the viral load (log/RNA copies/ml) ranging from 3.2 to 4.88; median 3.56.

4. Discussion

Here we have developed, validated and used a real-time RT-PCR assay to detect and quantify the two major causes of viral diar- rhea. The performance of the validated assays was controlled by the inclusion of a standardized internal control. The internal con- trol addition permits assurance of extraction, amplification, and quantitation, making these assays a robust for use in a clinical microbiology laboratory. Furthermore, these assays were tested throughout a large range of nucleic acid concentrations, producing reliable and reproducible quantitative results.
The target regions for the primers and probes for NoV and RoV have been well characterized and were originally designed by Pang et al. (2004) and Kageyama et al. (2003) for RoV and NoV, respectively. These methods have evolved and the primers and probes have been modified, incorporating degenerate nucleotides




Fig. 1. The viral load of RoV, NoVI and NoVII in stool samples. Box plots showing the median and interquartile range of RoV, NoVI and NoVII viral copy number in stool samples from children with and without diarrhea in HCMC, Viet Nam. Statistical significance between the samples from children with and without diarrhea was cal- culated using a two-tailed t-test; significant variation in viral copy number between samples is denoted at the head of the figure; significant p values are shown.

Kết quả (Việt) 1:

Đảng Cộng sản Romania +/ ĐTM + tại pha loãng 10−1 và tất cả đã là Đảng Cộng sản Romania +/ EIA− tại các10−3 pha loãng. Cho các mẫu tích cực NoVII, tất cả đã là Đảng Cộng sản Romania +/ EIA−ở pha loãng 10−3. Axít nucleic từ RoV PCR + và tháng mười một đảng Cộng sản Romania +mẫu được hợp nhất mười lần để đánh giá tiềm năng ức chế amplification gây ra bởi cross-reactivity. Các giá trị Cp đã không thay đổi trong các mẫu có chứa RoV và tháng mười một từ những người có chứa chỉ RoV hoặc tháng mười một.Chín mươi bốn phân mẫu từ các bệnh nhân với tiêu chảy và 94 phân mẫu từ các bệnh nhân mà không có tiêu chảy được điều tra của dự án và Đảng Cộng sản Romania RoV và tháng mười một (bảng 4). Kết quả dự án + trao đổi thư từ chính xác với chất lượng PCR kết quả cho RoV và NoVI/II. Ở trẻ em bị tiêu chảy, 10/94 (10,6%) mẫu đãĐảng Cộng sản Romania +/ EIA− cho RoV và 22/94 (23,4%) đã là Đảng Cộng sản Romania +/ EIA− cho tháng mười một.Ở trẻ em mà không có tiêu chảy, 0/94 mẫu đã là Đảng Cộng sản Romania +/ EIA−RoV và 7/94 (7,4%) mẫu đã là Đảng Cộng sản Romania +/ EIA− cho tháng mười một. CácĐảng Cộng sản Romania RoV +/ ĐTM + Cp giá trị mẫu đã được so sánh với các đảng Cộng sản Romania RoV +/ EIA− Cp giá trị. Giá trị Cp trung bình từ Đảng Cộng sản Romania RoV +/ ĐTM + mẫu là 15.3; giá trị Cp trung bình từ Đảng Cộng sản Romania RoV +/ EIA−mẫu là significantly cao tại 22,5 (p < 0,0001; hai đuôi t-thử nghiệm). Sự hiện diện của RoV và tháng mười một trong Đảng Cộng sản Romania +/ EIA− mẫu làconfirmed by PCR amplification of the VP7 and VP4 genes in the RoV+ samples and VP1 in the NoV+ samples (Yan et al., 2003; Gomara et al., 2001). All produced the expected amplifications. Sequencing of the resulting amplicons confirmed the real-time RT PCR results, demonstrating these samples contained either GI RoV or GII.4 NoV, respectively (data not shown).3.4. Quantitative PCR resultsThe PCRs were used to assess prevalence and quantitate NoV and RoV in stool samples from 217 children with diarrhea and 277 without diarrhea (including the 94 samples used to assess PCR sen- sitivity against EIA) (Fig. 1). From the samples from children with diarrhea, 101/217 (46.5%) were positive for RoV, 113/217 (52%) were positive for NoVII, 22/217 (10.1%) were positive for both RoV and NoVII and 0/217 were positive for NoVI. From the samples from children without diarrhea, 12/277 (4.3%) were positive for RoV,25/277 (9%) were positive for NoVII and 5/277 (1.8%) were positive for NoVI.Cp values were converted to copy number by use of a standard curve. The RoV loads in the samples from children with diarrhea were significantly higher than in the samples from children with- out diarrhea (with diarrhea; median = 10.06 log/RNA copies/ml (range; 5.56–12.49), without diarrhea; median = 8.33 log/RNA copies/ml (range; 5.43–10.52), p < 0.001, two tailed t-test) (Fig. 1). NoVII loads in the samples from children with diarrhea were significantly higher than in the samples from children without tiêu chảy (với tiêu chảy; trung bình = 6,85 đăng nhập/RNA bản sao/ml (phạm vi;2,89-9.71), mà không có tiêu chảy; Trung bình = 5,07 đăng nhập/RNA bản sao/ml (khoảng; 3,63-9.16), p = 0,02, hai đuôi t-thử nghiệm). Chỉ mẫu từ trẻ em không có tiêu chảy được thử nghiệm dương tính với NoVI, với tải virus (đăng nhập/RNA bản sao/ml) khác nhau, từ 3.2 4,88; Trung bình 3,56.4. thảo luậnỞ đây chúng tôi đã phát triển, xác nhận và sử dụng một khảo nghiệm RT-Đảng Cộng sản Romania thời gian thực để phát hiện và định lượng hai nguyên nhân chính của virus diar-rhea. Hiệu suất của thử nghiệm xác nhận được điều khiển bởi sự bao gồm của một kiểm soát nội bộ tiêu chuẩn hóa. Việc bổ sung nội bộ côn-trol cho phép bảo đảm của khai thác, amplification, và quantitation, làm cho các thử nghiệm một mạnh mẽ để sử dụng trong một phòng thí nghiệm vi sinh vật học lâm sàng. Hơn nữa, các thử nghiệm đã được thử nghiệm trong một phạm vi rộng lớn của nồng độ axit nucleic, sản xuất đáng tin cậy và thể sanh sản nhiều kết quả định lượng.Các vùng mục tiêu cho chất nền, mồi và đầu dò cho tháng mười một và RoV có được cũng đặc trưng và được thiết kế bởi Pang et al. (năm 2004) và Kageyama et al. (2003) cho RoV và tháng mười một, tương ứng. Những phương pháp này đã tiến hóa và các chất nền, mồi và đầu dò đã là modified, kết hợp thoái hóa nucleotide Fig. 1. The viral load of RoV, NoVI and NoVII in stool samples. Box plots showing the median and interquartile range of RoV, NoVI and NoVII viral copy number in stool samples from children with and without diarrhea in HCMC, Viet Nam. Statistical significance between the samples from children with and without diarrhea was cal- culated using a two-tailed t-test; significant variation in viral copy number between samples is denoted at the head of the figure; significant p values are shown.

Kết quả (Việt) 2:

PCR + / EIA + ở độ pha loãng 10-1 và tất cả đều PCR + / EIA- ở
độ pha loãng 10-3. Đối với các mẫu dương tính Novii, tất cả đều PCR + / EIA-
ở độ pha loãng 10-3. Axit nucleic từ PCR + RoV và NOV PCR +
mẫu được kết hợp trên mười dịp để đánh giá tiềm năng ức chế ampli fi cation gây ra bởi phản ứng chéo. Các giá trị Cp không thay đổi trong các mẫu có chứa RoV và NOV từ những chỉ chứa RoV hoặc nov.
Chín mươi bốn mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy và 94 mẫu phân của bệnh nhân mà không bị tiêu chảy được điều tra bởi EIA và PCR cho RoV và nov (Bảng 4) . EIA + kết quả tương ứng chính xác với kết quả PCR định tính cho RoV và Novi / II. Trong các trẻ em bị tiêu chảy, 10/94 (10,6%) mẫu được
PCR + / EIA- cho RoV và 22/94 (23,4%) là PCR + / EIA- cho nov.
Trong các trẻ em không tiêu chảy, 0/94 mẫu được PCR + / EIA-
cho RoV và 7/94 (7,4%) là mẫu PCR + / EIA- cho nov. Các
RoV PCR + / EIA + Cp giá trị mẫu được so sánh với các RoV PCR + / giá trị EIA- Cp. Giá trị trung bình Cp từ mẫu RoV PCR + / EIA + là 15,3; giá trị trung bình Cp từ RoV PCR + / EIA-
mẫu là trọng yếu fi đáng cao hơn 22,5 (p <0,0001; hai đuôi test t-). Sự hiện diện của RoV và nov trong mẫu + / EIA- PCR là
fi con rmed bởi PCR fi ampli cation của các gen VP7 và VP4 trong RoV + mẫu và VP1 trong Nov + mẫu (Yan et al, 2003;.. Gomara et al, 2001). Tất cả sản xuất các cation fi ampli dự kiến. Trình tự của amplicon dẫn con fi rmed các real-time RT PCR kết quả, thể hiện những mẫu chứa một trong hai GI RoV hoặc GII.4 NOV, tương ứng (dữ liệu không hiển thị). 3.4. PCR định lượng kết quả The PCR được sử dụng để đánh giá tỷ lệ và định lượng Nov và RoV trong các mẫu phân từ 217 trẻ em bị tiêu chảy và 277 mà không bị tiêu chảy (bao gồm 94 mẫu được sử dụng để đánh giá sitivity PCR sen- chống EIA) (Fig. 1). Từ các mẫu từ trẻ em bị tiêu chảy, 101/217 (46,5%) dương tính với RoV, 113/217 (52%) đã được tích cực cho Novii, 22/217 (10,1%) đã được tích cực cho cả RoV và Novii và 0/217 dương tính với Novi. Từ các mẫu từ trẻ em không tiêu chảy, 12/277 (4,3%) dương tính với RoV, 25/277 (9%) đã được tích cực cho Novii và 5/277 (1,8%) dương tính với Novi. giá trị Cp đã được chuyển đổi để sao chép số bằng cách sử dụng một đường cong chuẩn. Các tải RoV trong các mẫu từ trẻ em bị tiêu chảy là trọng yếu fi đáng cao hơn trong các mẫu từ con ra mà không tiêu chảy (tiêu chảy; trung bình = 10,06 log / RNA copies / ml (khoảng; 5,56-12,49), mà không bị tiêu chảy; trung bình = 8.33 log / RNA copies / ml (khoảng; 5,43-10,52)., p <0,001, hai đuôi t-test) (Hình 1). Tải Novii trong các mẫu từ trẻ em bị tiêu chảy là trọng yếu fi đáng cao hơn trong các mẫu từ trẻ em không có tiêu chảy (tiêu chảy; trung bình = 6.85 log / RNA copies / ml (khoảng; 2,89-9,71), mà không bị tiêu chảy; trung bình = 5,07 log / RNA copies / ml (khoảng; 3,63-9,16), p = 0.02, hai đuôi t-test). Chỉ có các mẫu từ trẻ em không có xét nghiệm dương tính với tiêu chảy Novi, với tải lượng virus (log / RNA copies / ml) khác nhau, 3,2-4,88; trung bình 3.56. 4. Thảo luận ở đây, chúng tôi đã phát triển, có giá trị và được sử dụng một xét nghiệm RT-PCR thời gian thực để phát hiện và định lượng hai nguyên nhân chủ yếu của virus tiêu chảy. Việc thực hiện các xét nghiệm xác nhận đã được kiểm soát bởi sự bao gồm của một kiểm soát nội bộ được chuẩn hóa. Các trol Ngoài con- nội bộ cho phép bảo đảm khai thác, ampli fi cation, và định lượng, làm các xét nghiệm một mạnh mẽ để sử dụng trong phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng. Hơn nữa, các xét nghiệm đã được thử nghiệm trong suốt một phạm vi rộng lớn của nồng độ axit nucleic, sản xuất kết quả định lượng đáng tin cậy và tái sản xuất. Các vùng mục tiêu cho các mồi và đầu dò cho nov và RoV đã được đặc trưng tốt và ban đầu được thiết kế bởi Pang et al. (2004) và Kageyama et al. (2003) cho RoV và NOV, tương ứng. Những phương pháp này đã tiến hóa và mồi và thăm dò đã được Modi fi ed, kết hợp nucleotide thoái hóa hình. 1. tải lượng virus của RoV, Novi và Novii trong mẫu phân. Lô hộp hiển thị trung bình và khoảng tứ phân vị của RoV, Novi và Novii số lượng bản sao virus trong các mẫu phân từ trẻ em có và không có bệnh tiêu chảy ở TP Hồ Chí Minh, Việt Nam. Thống kê trong yếu cance fi giữa các mẫu từ trẻ em có và không có tiêu chảy là cal- culated sử dụng một t-test hai đuôi; trong yếu biến fi không thể về số lượng bản sao của virus từ các mẫu được ký hiệu ở phần đầu của các Hình vẽ fi; trong yếu fi không thể p giá trị được hiển thị.