nologies; Benndorf et al. 2006). Ba

nologies; Benndorf et al. 2006). Based on the MS/MS data, search was done on a MASCOT server (Matrix Science, London, UK) against a genomic sequence of Myrioconium sp. laccase, which had been translated into amino acids. The molecular mass of the laccase was also determined by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flightmass spectrometry (MALDI-TOF-MS), using a Bruker ultraflex III TOF/TOF (Bruker, Bremen, Germany). The purifiedlaccaseproteinwasprecipitatedwitha20%trichloroacetic acid solution (volume ratio 1:1) and re-suspended in bidestilled water. A thin layer of ethanol saturated with sinapinic acid (SA) served as matrix on a MTPAnchorChip 600-384 target (Bruker). Samples were diluted with a saturated solution of SA in a mixture of acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid (volume ratio 1:2). Using the double layer method, 0.5μl of this solution was spotted onto the SA layer and analyzed in linear positive ion mode. The mass spectra were calibrated externally with the Protein Calibration Standard II (Bruker).
Enzymatic determinations Laccase activities were routinely determined following the oxidation of 3 mM ABTS in 0.1 M citrate–phosphate buffer (pH 4.0) at 420 nm [ɛ420= 36 mM−1 cm−1 (Johannes and Majcherczyk 2000)] at 25°C. Where indicated, the oxidation of 2,6-dimethoxyphenol [2,6-DMP; ɛ469=27.5 mM-1 cm-1, referred to as 2,6-DMP concentration (Saparrat et al. 2002)] and syringaldazine (ɛ520=62.4 mM−1 cm−1) was followed at 470 and 520 nm, respectively, using a Genios+ microplate reader (Tecan, Crailsheim, Germany) equipped with the respective absorbance filters. The extinction coefficient used for syringaldazine was based on a spectral scan of the product derived from the laccase-catalyzed oxidation of syringaldazine, which was performed on a Cary 400 Scan spectrophotometer (Varian, Palo Alto, CA, USA). A literature value of ɛ525=65.0 mM−1 cm−1 (Soden et al. 2002) was used to calculate the extinction coefficient at 520 nm. The oxidation of 0.1 mM tyrosine was checked for the laccase-containing concentrated culture supernatant in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) at 280 nm (Berg et al. 2002) and 25°C. Enzyme activities are expressed as international units (U), where 1 U corresponds to 1 μmol of product formed per minute. Michaelis-Menten constants (Km) and kcat values of the purified laccase were determined for ABTS, syringaldazine, and 2,6-DMP as substrates, using the initial oxidation rates observed at substrate concentrations ranging from 0.2 to 600 μM (ABTS and DMP) and from 0.01 to 10 μM (syringaldazine) in 0.1 M citrate–phosphate buffer (pH 4 for ABTS and 2,6-DMP, pH 6 for syringaldazine) at 25°C. The enzyme kinetics module 1.1 of the SigmaPlot 2001 software (Systat Software, San Jose, CA, USA) was used to calculate Km and kcat values upon non-linear regression of the obtained experimental data, which yielded correlatio

Kết quả (Việt) 1:

nologies; Benndorf et al. 2006). Dựa trên dữ liệu MS/MS, tìm kiếm được thực hiện trên một máy chủ MASCOT (khoa học ma trận, Luân Đôn, Vương Quốc Anh) với một trình tự gen của Myrioconium sp. laccase, đã được dịch thành các axit amin. Khối lượng phân tử của laccase cũng được xác định bởi sự trợ giúp của ma trận laser desorption/ion hóa-thời gian của flightmass spectrometry (MALDI-TOF-MS), bằng cách sử dụng một ultraflex Bruker III TOF/TOF (Bruker, Bremen, Đức). Giải pháp purifiedlaccaseproteinwasprecipitatedwitha20% Axit tricloaxetic (khối lượng tỷ lệ 1:1) và bidestilled lại bị đình chỉ trong nước. Một lớp mỏng ethanol bão hòa với các axít sinapinic (SA) phục vụ như là các ma trận trên một mục tiêu MTPAnchorChip 600-384 (Bruker). Mẫu đã được pha loãng với một dung dịch bão hòa của SA trong một hỗn hợp của acetonitrile và 0,1% trifluoroacetic axit (khối lượng tỉ lệ 1:2). Sử dụng các phương pháp lớp kép, 0.5μl của giải pháp này được phát hiện vào lớp SA và phân tích trong chế độ tuyến tính tích cực ion. Quang phổ khối lượng đã được hiệu chỉnh bên ngoài với các Protein hiệu chuẩn chuẩn II (Bruker).Quyết định enzym Laccase hoạt động thường xuyên được xác sau quá trình oxy hóa của 3 mM ABTS trong vùng đệm citrate-phosphate 0.1 M (pH 4.0) tại 420 nm [ɛ420 = 36 mM−1 cm−1 (Johannes và Majcherczyk 2000)] ở 25° C. Trong trường hợp được chỉ định, quá trình oxy hóa của 2,6-dimethoxyphenol [2,6-DMP; ɛ469 = 27.5 mM-1 cm-1, được gọi là 2,6-DMP tập trung (Saparrat và ctv 2002)] và syringaldazine (ɛ520 = 62,4 mM−1 cm−1) sau đó là tại 470 và 520 nm, tương ứng, sử dụng một Genios + microplate reader (Tecan, Crailsheim, Đức) được trang bị bộ lọc tương ứng hấp thu. Hệ số tuyệt chủng được sử dụng cho syringaldazine được dựa trên một máy quét quang phổ của các sản phẩm có nguồn gốc từ laccase xúc tác quá trình oxy hóa của syringaldazine, được thực hiện trên một Cary 400 quét phối (Varian, Palo Alto, CA, USA). Một giá trị văn học của ɛ525 = 65,0 mM−1 cm−1 (Soden ctv 2002) đã được sử dụng để tính toán hệ số tuyệt chủng tại 520 nm. Quá trình oxy hóa tyrosin 0,1 mM đã được kiểm tra cho laccase có chứa tập trung văn hóa supernatant trong vùng đệm phosphate 50 mM (pH 6.5) tại 280 nm (Berg và ctv 2002) và 25° C. Các hoạt động của enzyme được thể hiện là đơn vị quốc tế (U), nơi 1 U tương ứng với 1 μmol của sản phẩm hình thành mỗi phút. Hằng số Michaelis-Menten (Km) và kcat giá trị của tinh khiết laccase đã được xác định cho ABTS, syringaldazine và 2,6-DMP như là chất nền, bằng cách sử dụng tỷ giá quá trình oxy hóa ban đầu được quan sát thấy ở nồng độ bề mặt khác nhau, từ 0,2 đến 600 μM (ABTS và DMP) và từ 0,01 đến 10 μM (syringaldazine) trong 0.1 M các bộ đệm citrate-phosphate (pH 4 cho ABTS và 2,6-DMP), pH 6 cho syringaldazine ở 25° C. Enzyme kinetics module 1.1 phần mềm SigmaPlot 2001 (phần mềm Systat, San Jose, CA, USA) đã được sử dụng để tính toán giá trị Km và kcat khi hồi qui phi tuyến của dữ liệu thử nghiệm thu được, mang correlatio

Kết quả (Việt) 2:

những công; Benndorf et al. 2006). Dựa trên các dữ liệu MS / MS, tìm kiếm được thực hiện trên một máy chủ Mascot (Matrix Khoa học, London, Vương quốc Anh) với một trình tự bộ gen của các Myrioconium sp. laccase, vốn đã được dịch thành các axit amin. Khối lượng phân tử của laccase cũng đã được xác định bởi ma trận hỗ trợ giải hấp laser / ion hóa thời gian của flightmass phổ (MALDI-TOF-MS), sử dụng một Bruker ULTRAFLEX III TOF / TOF (Bruker, Bremen, Đức). Các purifiedlaccaseproteinwasprecipitatedwitha20% dung dịch axit tricloaxetic (khối lượng tỷ lệ 1: 1) và tái lơ lửng trong nước bidestilled. Một lớp mỏng ethanol bão hòa với axit sinapinic (SA) phục vụ như là ma trận vào một mục tiêu MTPAnchorChip 600-384 (Bruker). Các mẫu được pha loãng với dung dịch bão hòa của SA trong hỗn hợp acetonitril và 0,1% axit trifluoroacetic (tỷ lệ thể tích 1: 2). Sử dụng phương pháp lớp kép, 0.5μl của giải pháp này đã được phát hiện vào lớp SA và phân tích chế độ ion dương tuyến tính. Các quang phổ khối được hiệu chuẩn bên ngoài với Protein hiệu chuẩn Tiêu chuẩn II (Bruker).
Quyết định enzyme hoạt động Laccase được xác định thường xuyên sau quá trình oxy hóa của 3 mM ABTS trong 0,1 M citrate-đệm phosphat (pH 4.0) tại 420 nm [ɛ420 = 36 mM- 1 cm-1 (Johannes và Majcherczyk 2000)] ở 25 ° C. Đó chỉ ra, quá trình oxy hóa của 2,6-dimethoxyphenol [2,6-DMP; ɛ469 = 27,5 mM-1 cm-1, được gọi là 2,6-DMP nồng độ (Saparrat et al. 2002)] và syringaldazine (ɛ520 = 62,4 mM-1 cm-1) được theo sau ở 470 và 520 nm, tương ứng, sử dụng một đầu đọc microplate Genios + (TECAN, Crailsheim, Đức) được trang bị bộ lọc hấp thụ tương ứng. Các hệ số tắt sử dụng cho syringaldazine được dựa trên một máy quét quang phổ của các sản phẩm có nguồn gốc từ quá trình oxy hóa laccase xúc tác của syringaldazine, được thực hiện trên một Cary 400 quang phổ Scan (Varian, Palo Alto, CA, USA). Một giá trị văn học của ɛ525 = 65,0 mM-1 cm-1 (Soden et al. 2002) đã được sử dụng để tính toán hệ số dập tắt tại 520 nm. Các quá trình oxy hóa của 0,1 mM tyrosine đã được kiểm tra bộ đệm laccase có chứa nổi nền văn hóa tập trung trong 50 mM phosphate (pH 6.5) ở 280 nm (Berg et al. 2002) và 25 ° C. Hoạt động enzyme được biểu diễn như các đơn vị quốc tế (U), trong đó 1 U tương ứng với 1 mol của sản phẩm hình thành trong mỗi phút. Michaelis-Menten hằng (Km) và các giá trị kcat của laccase tinh sạch được xác định cho ABTS, syringaldazine, và 2,6-DMP làm chất nền, bằng cách sử dụng tốc độ ôxy hoá ban đầu quan sát thấy ở nồng độ chất nền khác nhau, 0,2-600 mM (ABTS và DMP) và 0,01-10 mM (syringaldazine) trong 0,1 M đệm citrate phosphate (pH 4 cho ABTS và 2,6-DMP, pH 6 cho syringaldazine) ở 25 ° C. Động học enzyme phân hệ 1.1 của phần mềm SigmaPlot 2001 (SYSTAT Phần mềm, San Jose, CA, USA) được sử dụng để tính toán Km và giá trị kcat khi hồi quy phi tuyến tính của các dữ liệu thực nghiệm thu được, mà mang lại correlatio