Phage therapy agains




Phage therapy againstVibrio parahaemolyticusinfection in the whiteleg
shrimp (Litopenaeus vannamei) larvae
Carlos O. Lomel´ı-Ortega, Sergio F. Mart´ ınez-D´ ıaz
PII: S0044-8486(14)00410-4
DOI: doi:10.1016/j.aquaculture.2014.08.018
Reference: AQUA 631302
To appear in: Aquaculture
Received date: 14 July 2014
Revised date: 8 August 2014
Accepted date: 12 August 2014
Please cite this article as: Lomel´ı-Ortega, Carlos O., Mart´ ınez-D´ ıaz, Sergio F., Phage
therapy againstVibrio parahaemolyticusinfection in the whiteleg shrimp (Litopenaeus van-namei)larvae,Aquaculture(2014), doi: 10.1016/j.aquaculture.2014.08.018
This is a PDF file of an unedited manuscript that has been accepted for publication.
As a service to our customers we are providing this early version of the manuscript.
The manuscript will undergo copyediting, typesetting, and review of the resulting proof
before it is published in its final form. Please note that during the production process
errors may be discovered which could affect the content, and all legal disclaimers that
apply to the journal pertain.
ACCEPTED MANUSCRIPT
ACCEPTED MANUSCRIPT
1
Title:
Phage therapy against Vibrio parahaemolyticus infection in the whiteleg
shrimp (Litopenaeus vannamei) larvae
Running title
Phage therapy for VP in whiteleg shrimp
Authors:
Carlos O. Lomelí-Ortega, Sergio F. Martínez-Díaz*
* Corresponding author
Author Affiliation:
Instituto Politécnico Nacional. Microbiology and Molecular Biology Lab.
CICIMAR, Av. Instituto Politécnico Nacional sn. Col Playa Palo de Sta Rita. La
Paz, Baja California Sur, Mexico CP. 23090 Tel. [phone], Fax. (+52)
61225322 e-mail [e-mail]
ACCEPTED MANUSCRIPT
ACCEPTED MANUSCRIPT
2
Abstract
Vibrio parahaemolyticus is an important cause of disease, mortality, and
economical losses in the shrimp aquaculture industry. Bacteriophages are
natural bio-controlling agents, broadly recognized for their ability to reduce
pathogen populations. Hence, in the present study, we evaluated the
effectiveness of phage therapy in the prevention and control of vibriosis in
Litopenaeus vannamei. Vibriosis was induced in shrimp larvae with 2 • 10
6
CFU
• mL
-1
of V. parahaemolyticus. The infected larvae were treated with different
doses of selected phages and their efficacy was evaluated at different times
after their application. Results revealed that selected lytic phages (A3S and
Vpms1) are effective to reduce mortality caused by V. parahaemolyticus. In
both cases, the early application (at 6 hours post-infection) was effective to
avoid mortality. Low multiplicity of infection (MOI) values (< 0.1) were enough to
counteract V. parahaemolyticus infection. Delayed phage applications (> 6
hours post-infection) hindered mortality and the progress of infection. This study
provides the basis for the use of bacteriophages in the prevention and control of
V. parahaemolyticus in shrimps.
Keywords
Phage therapy, Litopenaeus vannamei, Vibrio parahaemolyticus, Shrimp larvae
ACCEPTED MANUSCRIPT
ACCEPTED MANUSCRIPT
3
1. Introduction
Vibrio spp. are the putative cause of strong economic losses in the shrimp
industry; they can infect all life stages (from eggs to broodstock); generating in
most cases 100% mortality (Prayitno & Latchford, 1995; Harris & Owens, 1999;
Aguirre-Guzmán et al., 2010).
Vibrio parahaemolyticus (VP) is a Gram-negative bacterium that has been
commonly associated with infections in aquatic organisms. In addition, it is a
major concern for human health because it is a leading cause of seafood-borne
bacterial gastroenteritis worldwide (DePaola et al., 2003; Gopal et al., 2005;
Zimmerman et al., 2007, Turner et al., 2013). In Mexican shrimp hatcheries, the
presence of VP is monitored frequently and has been associated with necrosis,
slow growth, muscle opacity, anorexia, and mortality during seed production
(Balcázar et al., 2007; Aguirre-Guzmán et al., 2010). During 2013, some strains
of VP were reported as the etiological agent of the acute hepatopancreatic
necrosis syndrome (AHPNS/ESM) that caused the collapse of the shrimp
aquaculture in Asia (Tran et al., 2013) and Mexico.
Currently there are scarce alternatives to control vibriosis during shrimp rearing,
including some disinfectants and few legally allowed antibiotics (Santiago et al.,
2009; Labreuche, 2012). However, new promising approaches are under
development and, apparently, some of them can provide an acceptable level of
control of pathogenic vibrios with little or null environmental damage.
The potential of phage therapy (use of bacteriophages to control bacterial
infections) in aquaculture is gaining the interest of the scientific community and,
during the last 5 years, different opinions and multiple reviews have been
published. However, few efforts have been made to validate their efficacy or the
ACCEPTED MANUSCRIPT
ACCEPTED MANUSCRIPT
4
possible impacts associated with the massive releasing of phages to the
environment.
The early evaluations of phage therapy to prevent vibriosis produced very
encouraging results; for example, during experimental shrimp larval production,
Vinod et al. (2006) demonstrated that the application of V. harveyi phages
improves survival rate, even when compared with antibiotic-treated organisms.
However, we can expect that, under commercial conditions, their actual
effectiveness or apparent beneficial effect will be linked to the presence of
specific pathogens, because phages have a narrow hosts range, and their
ability to control ongoing infections is still unknown. Therefore, at this time, it is
crucial to generate models to assess the conditions under which the phage
therapy is effective and the factors that affect their efficacy. In the present study,
we evaluated phage therapy as an alternative to prevent and control the
damage produced by VP in the whiteleg shrimp larvae.
2. Methods
2.1 Bacteria and phages
V. parahaemolyticus ATCC 17802 was obtained directly from the American
Type Culture Collection (ATCC). The stocks were maintained at -50 ºC with
50% glycerol. For experiments, bacteria were cultured in marine agar (MA) and
the cells were harvested at 24 h and adjusted at an optic density of 1 at 585 nm
(OD
585 = 1) (corresponding at ca. 10
8
CFU ml
−1
) in artificial sea water (ASW)
(Instant Ocean®).The phages A3S and Vpms1 used in this study were
previously isolated from healthy shrimp cultures (Makarov, 2008) and clams
(Martínez-Díaz and Hipólito-Morales, 2013), respectively. Phage stocks were
ACCEPTED MANUSCRIPT
ACCEPTED MANUSCRIPT
5
produced at 30 ºC in fresh VP cultures; the lysates were centrifuged at 3500
rpm to eliminate bacterial debris and then filtered through 0.02-µm membranes.
The number of viable phages was quantified by standard PFU counts and
stored at 4 ºC until use.
2.2 Shrimp larvae
Shrimp larvae at nauplius III stage were obtained from two commercial
hatcheries (Acuacultura Mahr SA de CV, La Paz, BCS, Mexico, and
BIOGEMAR SA, Salinas, Ecuador). For each experiment, a group of apparently
healthy larvae (obtained from the collective spawn of at least 10 females) were
transported to the laboratory and maintained in the carrying boxes until
reaching the nauplius IV-V stage (N IV-V), then they were disinfected with 0.3
ppm chlorine dioxide (ClO2
) during 5 min, washed with sterile sea water and
distributed in sterile containers with 100 mL artificial seawater (ASW) (Instant
Ocean at 35 ppt) at a density of 1 larva • mL
-1
. At 24 h after disinfection,
different treatments were applied (including infection or phage therapy) and
maintained during 96 h at 30 ºC. A gnotobiotic culture of Chaetoceros calcitrans
was provided as the sole food source during experiments: at an initial dose of 1
• 10
4
cell·mL
-1
and, successively, adjusting to 1 • 10
5
cell • mL
-1
.
2.3 V. parahamolyticus challenge and phage therapy
Groups of 100 larvae (previously disinfected with ClO
2
and acclimatized as
described in the section 2.2) were infected in the same container with a single
dose of VP at 2 • 10
6
CFU • mL
-1
and treated with 100 μL of Vpms1 or A3S
phage suspensions. Groups of VP-infected larvae that were no treated with
ACCEPTED MANUSCRIPT
ACCEPTED MANUSCRIPT
6
phages were used as positive controls and uninfected larvae were used as
negative controls or blanks. Each treatment was assayed in triplicate and the
survival rate and vibriosis signs were recorded at 96 hpi (hours post infection).
2.4 Minimal effective dose of phages to control VP effects
Eighteen groups of 100 larvae at 24 h (previously disinfected with ClO
2
and
acclimatized as described in the section 2.2) were infected with VP (at a 2 • 10
6
CFU·mL
-1
dose). The containers were randomly selected in groups of three and
treated with different volumes of A3S or Vpms1 phages, to reach MOI values of
0.1, 1, and 10. Positive and negative controls (as previously described) were
simultaneously maintained and all groups were analyzed at 96 hpi.
2.5 Effect of delayed application of phage therapy
Twenty-four groups of 100 larvae (previously disinfected with ClO
2
and
acclimatized as described in the section 2.2) were simultaneously infected with
VP (at a 2 • 10
6
CFU • mL
-1
dose), triplicate groups were randomly selected to
be treated with phages at different times (0, 6, 12, 24, and 36 hpi). Treatments
comprised a single dose of 100 μL of Vpms1 or A3S phage suspension
(reaching MOI values of 1 and 2, respectively). Positive and negative controls
(as previously described) were maintained simultaneously and all groups were
analyzed at 96 hpi.
2.6 Statistical Analysis
ACCEPTED MANUSCRIPT
ACCEPTED MANUSCRIPT
7
Normality and homos

Kết quả (Việt) 1:

 Liệu pháp thực bào phage againstVibrio parahaemolyticusinfection trong thẻ chân trắngẤu trùng ăn tôm (Litopenaeus vannamei)Carlos O. Lomel´ı-Ortega, Sergio F. Mart´ ınez-D´ ıazPII: S0044-8486 (14) 00410-4DOI: doi:10.1016/j.aquaculture.2014.08.018Tham khảo: AQUA 631302Xuất hiện trong: nuôi trồng thủy sảnNhận được ngày: 14 tháng 7 năm 2014Sửa đổi ngày: 8 tháng 8 năm 2014Chấp nhận ngày: 12 tháng 8 năm 2014Xin vui lòng trích dẫn bài viết này là: Lomel´ı-Ortega, Carlos O., Mart´ ınez-D´ ıaz, Sergio F., Phageđiều trị againstVibrio parahaemolyticusinfection ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus van-namei)larvae,Aquaculture(2014), doi: 10.1016/j.aquaculture.2014.08.018Đây là một tập tin PDF của một bản thảo không chỉnh sửa mà đã được chấp nhận cho xuất bản.Như là một dịch vụ cho khách hàng của chúng tôi, chúng tôi đang cung cấp này phiên bản đầu của bản thảo.Bản thảo sẽ trải qua copyediting, sắp chữ, và xem xét các bằng chứng kết quảtrước khi nó được xuất bản ở dạng cuối cùng của nó. Xin lưu ý rằng trong quá trình sản xuấtlỗi có thể được phát hiện ra mà có thể ảnh hưởng đến các lời phủ nhận nội dung, và tất cả pháp lý màáp dụng cho các tạp chí liên quan.BẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬNBẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬN1Tiêu đề:Liệu pháp thực bào phage chống Vibrio parahaemolyticus nhiễm trong thẻ chân trắng Ấu trùng ăn tôm (Litopenaeus vannamei)Tiêu đề chạyLiệu pháp thực bào phage cho VP tại tôm thẻ chân trắngTác giả:Carlos O. Lomelí-Ortega, Sergio F. Martínez-Díaz ** Tương ứng tác giảLiên kết tác giả:Instituto Politécnico Nacional. Vi sinh vật học và phòng thí nghiệm sinh học phân tử. CICIMAR, Av. Instituto Politécnico Nacional sn. Col Playa Palo de Sta Rita. La Paz, Baja California Sur, Mexico CP 23090 ĐT [phone], Fax. [phone] e-mail [e-mail]ẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬNBẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬN2Tóm tắtVibrio parahaemolyticus là một nguyên nhân quan trọng của bệnh, tỷ lệ tử vong, và thiệt hại kinh tế trong ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản tôm. Bacteriophage tự nhiên tác nhân kiểm soát sinh học, được công nhận rộng rãi cho khả năng của họ để giảm Quần thể gây bệnh cho cây. Do đó, trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đánh giá các hiệu quả của liệu pháp thực bào phage trong công tác phòng chống và kiểm soát của vibriosis trong Litopenaeus vannamei. Vibriosis đã gây ra ở tôm ấu trùng với 2 • 106CFU• mL-1của V. parahaemolyticus. Ấu trùng ăn bị nhiễm đã được điều trị với khác nhau liều đã chọn phage và hiệu quả của họ được đánh giá tại thời điểm khác nhau sau khi ứng dụng của họ. Kết quả cho thấy rằng lựa chọn lytic phage (A3S và Vpms1) có hiệu quả để giảm tỷ lệ tử vong do V. parahaemolyticus. Ở cả hai trường hợp, các ứng dụng đầu (lúc 6 giờ sau nhiễm trùng) là có hiệu quả để tránh tử vong. Các đa dạng thấp của nhiễm trùng (MOI) giá trị (< 0.1) đã đủ để chống lại V. parahaemolyticus nhiễm trùng. Ứng dụng bị trì hoãn thực khuẩn (> 6 nhiễm trùng sau giờ) cản trở các tỷ lệ tử vong và sự tiến bộ của nhiễm trùng. Nghiên cứu này cung cấp cơ sở cho việc sử dụng của bacteriophage trong công tác phòng chống và kiểm soát V. parahaemolyticus trong tôm.Từ khóaLiệu pháp thực bào phage, Litopenaeus vannamei, Vibrio parahaemolyticus, tôm ấu trùngBẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬNBẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬN31. giới thiệuVibrio spp. là nguyên nhân giả định mạnh mẽ kinh tế tổn thất trong tôm ngành công nghiệp; họ có thể lây nhiễm tất cả các giai đoạn của cuộc sống (từ trứng để broodstock); tạo ra trong Hầu hết các trường hợp tử vong 100% (Prayitno & Latchford, 1995; Harris & Owens, 1999; Aguirre-Guzmán et al., 2010).Vibrio parahaemolyticus (VP) là một loại vi khuẩn Gram âm đã thường liên quan đến nhiễm trùng trong thủy sinh vật. Ngoài ra, nó là một các mối quan tâm cho sức khỏe con người vì nó là một nguyên nhân hàng đầu của Hải sản-borne vi khuẩn viêm dạ dày ruột trên toàn thế giới (DePaola et al., 2003; David et al., 2005; Zimmerman et al., năm 2007, Turner et al., 2013). Ở Mexico tôm trại, các sự hiện diện của VP theo dõi thường xuyên và đã được liên kết với hoại tử, tốc độ tăng trưởng chậm, cơ bắp opacity, chán ăn, và tỷ lệ tử vong trong sản xuất hạt giống (Balcázar et al., 2007; Aguirre-Guzmán et al., 2010). Trong năm 2013, một số chủng VP đã được báo cáo như là các đại lý thần của hepatopancreatic cấp tính Hội chứng hoại tử (AHPNS/ESM) gây ra sự sụp đổ của tômnuôi trồng thủy sản ở Châu á (trần và ctv., 2013) và Mexico.Hiện nay có rất khan hiếm lựa chọn thay thế để kiểm soát vibriosis trong tôm nuôi, bao gồm một số khử và ít hợp pháp cho phép kháng sinh (Santiago et al., năm 2009; Labreuche, 2012). Tuy nhiên, phương pháp tiếp cận mới hứa hẹn dưới phát triển và rõ ràng, một số người trong số họ có thể cung cấp một mức độ chấp nhận được của kiểm soát các vibrios với ít hoặc không thiệt hại môi trường.Tiềm năng của liệu pháp thực bào phage (sử dụng bacteriophage để kiểm soát vi khuẩn nhiễm trùng) trong nuôi trồng thủy sản là đạt được sự quan tâm của cộng đồng khoa học và,trong 5 năm gần đây, ý kiến khác nhau và nhiều đánh giá đã được xuất bản. Tuy nhiên, vài nỗ lực đã được thực hiện để xác nhận hiệu quả của họ hoặc các BẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬNBẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬN4tác động có thể kết hợp với phát hành lớn của phage để các môi trường.Các đánh giá đầu của liệu pháp thực bào phage để ngăn chặn vibriosis sản xuất rất kết quả đáng khích lệ; Ví dụ, trong thời gian thử nghiệm tôm ấu trùng sản xuất,Vinod et al. (2006) chứng minh rằng các ứng dụng của V. harveyi phage cải thiện tỷ lệ sống, ngay cả khi so sánh với điều trị kháng sinh vật. Tuy nhiên, chúng tôi có thể hy vọng rằng, trong điều kiện thương mại, của thực tế tính hiệu quả hoặc có hiệu lực mang lại lợi ích rõ ràng sẽ được liên kết với sự hiện diện của tác nhân gây bệnh cụ thể, bởi vì phage có một phạm vi hẹp máy chủ, và của họ khả năng kiểm soát bệnh nhiễm trùng đang diễn ra là vẫn còn chưa biết. Vì vậy, tại thời điểm này, nó là rất quan trọng để tạo ra các mô hình để đánh giá các điều kiện theo đó phage trị liệu là có hiệu quả và các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của họ. Trong nghiên cứu hiện tại,chúng tôi đánh giá liệu pháp thực bào phage là một cách thay thế để ngăn ngừa và kiểm soát các thiệt hại sản xuất bởi VP của ấu trùng đối vào tôm thẻ chân trắng.2. phương pháp2.1 vi khuẩn và phageV. parahaemolyticus ATCC 17802 được lấy trực tiếp từ những người Mỹ Loại văn hóa bộ sưu tập (ATCC). Các cổ phiếu đã được duy trì ở-50 ºC với Nhóm glycerol 50%. Cho các thí nghiệm, vi khuẩn được nuôi cấy trong biển agar (MA) và Các tế bào đã được thu hoạch tại 24 h và điều chỉnh ở mật độ quang của 1 tại 585 nm (OD585 = 1) (tương ứng tại ca. 108CFU ml−1) trong nước biển nhân tạo (ASW) (Instant Ocean ®).Phage A3S và Vpms1 được sử dụng trong nghiên cứu này đã trước đó bị cô lập từ nền văn hóa lành mạnh tôm (Makarov, 2008) và trai (Martínez-Díaz và Hipólito-Morales, 2013), tương ứng. Phage cổ phiếu BẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬNBẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬN5sản xuất tại 30 ºC trong nền văn hóa VP tươi; Các lysates đã ly tại 3500 vòng/phút để loại bỏ vi khuẩn mảnh vỡ và sau đó lọc qua 0,02-μm màng. Số khả thi phage được định lượng theo tiêu chuẩn PFU đếm và lưu giữ tại 4 ºC cho đến khi sử dụng.2.2 ấu trùng ăn tômẤu trùng ăn tôm ở nauplius III giai đoạn đã được thu được từ hai thương mại trại (Acuacultura Mahr SA de CV, La Paz, BCS, Mexico, và BIOGEMAR SA, Salinas, Ecuador). Cho mỗi thử nghiệm, một nhóm các rõ ràng Ấu trùng ăn lành mạnh (thu được từ tập thể đẻ trứng của ít nhất 10 nữ) vận chuyển đến phòng thí nghiệm và duy trì trong các hộp mang theo cho đến khiđến giai đoạn IV-V nauplius (N IV-V), sau đó họ đã được khử trùng với 0.3 ppm điôxit clo (ClO2) trong 5 phút, rửa sạch với nước biển vô trùng và phân phối trong các thùng chứa vô trùng với 100 mL nước biển nhân tạo (ASW) (tức thì Dương tại 35 ppt) tại với mật độ của 1 ấu trùng • mL-1. Tại 24 h sau khi khử trùng,phương pháp điều trị khác nhau được áp dụng (bao gồm cả điều trị nhiễm trùng hoặc phage) và duy trì trong 96 h 30 ºC. Một nền văn hóa gnotobiotic Chaetoceros calcitransđược cung cấp như là nguồn gốc duy nhất thực phẩm trong thí nghiệm: tại một liều đầu tiên của 1• 104Cell·ml-1và đã liên tục, điều chỉnh để 1 • 105di động • mL-1.2.3 V. parahamolyticus thách thức và phage therapyNhóm của ấu trùng 100 (trước đó khử trùng với ClO2và tolerant như Mô tả trong phần 2.2) đã bị nhiễm bệnh trong các thùng chứa tương tự với đĩa đơn liều của VP tại 2 • 106CFU • mL-1và được điều trị với 100 μL Vpms1 hoặc A3S đình chỉ phage. Nhóm của VP nhiễm ấu trùng đã không được điều trị với BẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬNBẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬN6phage được sử dụng như tích cực điều khiển và nhiễm ấu trùng được sử dụng như tiêu cực điều khiển hoặc trống. Mỗi lần chữa trị được assayed trong triplicate và các dấu hiệu sự sống còn tỷ lệ và vibriosis đã được thu âm tại 96 hpi (giờ sau nhiễm trùng).2.4 liều lượng hiệu quả tối thiểu của phage để kiểm soát VP hiệu ứngMười tám nhóm các ấu trùng 100 tại 24 h (trước đó khử trùng với ClO2và di thực như được diễn tả trong phần 2.2) bị nhiễm với VP (lúc 2 • 106CFU·ml-1liều). Các thùng chứa được lựa chọn ngẫu nhiên trong nhóm ba vàđiều trị bằng các khối lượng khác nhau của A3S hoặc Vpms1 phage, để đạt được giá trị MOI 0.1, 1 và 10. Đã tích cực và tiêu cực điều khiển (như đã mô tả) đồng thời duy trì và tất cả các nhóm được phân tích tại 96 hpi.2.5 các tác động của các ứng dụng bị trì hoãn của liệu pháp thực bào phageHai mươi bốn nhóm 100 ấu trùng (trước đó khử trùng với ClO2và di thực như được diễn tả trong phần 2.2) đã được cùng một lúc bị nhiễm VP (lúc 2 • 106CFU • mL-1liều), triplicate nhóm ngẫu nhiên đã được lựa chọn để được điều trị bằng phage vào các thời điểm khác nhau (0, 6, 12, 24, và 36 hpi). Phương pháp điều trị bao gồm một liều duy nhất 100 μL tạm dừng phage Vpms1 hoặc A3S(đạt MOI giá trị 1 và 2, tương ứng). Tích cực và tiêu cực điều khiển (như được mô tả trước đó) đã được duy trì cùng một lúc và tất cả các nhóm phân tích tại 96 hpi.2.6 phân tích thống kê BẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬNBẢN THẢO ĐƯỢC CHẤP NHẬN7Bình thường và homos