RESEARCH PAPEREmodin is a novel alk

RESEARCH PAPER
Emodin is a novel alkaline nuclease inhibitor that
suppresses herpes simplex virus type 1 yields in cell
cultures
C-Y Hsiang1 and T-Y Ho2
1
Department of Microbiology, China Medical University, Taichung, Taiwan and 2
Graduate Institute of Chinese Medical Science,
China Medical University, Taichung, Taiwan
Background and purpose: Most antiviral therapies directed against herpes simplex virus (HSV) infections are limited to a small
group of nucleoside analogues that target the viral polymerase. Extensive clinical use of these drugs has led to the emergence
of resistant viral strains, mainly in immunocompromised patients. This highlights the need for the development of new antiherpesviral
drugs with novel targets. Herein the effects of a plant anthraquinone, emodin, on the HSV-1 alkaline nuclease
activity and virus yields were investigated.
Experimental approach: HSV-1 alkaline nuclease activity was examined by nuclease activity assay. Inhibition of virus yields
was measured by plaque reduction assay and immunohistochemical staining. Interaction between emodin and alkaline
nuclease was analysed by docking technology.
Key results: Emodin specifically inhibited the nuclease activity of HSV-1 UL12 alkaline nuclease in a biochemical assay. Plaque
reduction assay revealed that emodin reduced the plaque formation with an EC50 of 21.5±4.4 mM. Immunohistochemical
staining using the anti-nucleocapsid protein antibody demonstrated that emodin induced the accumulation of viral
nucleocapsids in the nucleus in a dose-dependent manner. Docking analysis further suggested that the inhibitory effect
of emodin on the UL12 activity may result from the interaction between emodin and critical catalytic amino acid residues of
UL12.
Conclusions and implications: Our findings suggest that emodin is a potent anti-HSV agent that inhibits the yields of HSV-1
via the suppression of a novel target, UL12.
British Journal of Pharmacology (2008) 155, 227–235; doi:10.1038/bjp.2008.242; published online 16 June 2008
Keywords: herpes simplex virus type 1; emodin; alkaline nuclease
Abbreviations: CK2, casein kinase 2; DMSO, dimethyl sulphoxide; FITC, fluorescein; HSV, herpes simplex virus; MTT, 3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; PBS, phosphate-buffered saline; PFU, plaque-forming
unit
Introduction
Herpes simplex virus (HSV) causes herpes labialis, herpes
keratitis, genetic herpes and life-threatening herpes encephalitis.
HSV infections are more severe in immunocompromised
patients, which are characterized by chronic and
extensive lesions of the mucous membranes (Whitley, 2001).
Most therapies directed against HSV infections are nucleotides,
nucleosides or pyrophosphate analogues, such as
acyclovir, valacyclovir, penciclovir and famciclovir. After
uptake by virus-infected cells, these drugs are phosphorylated
by virus-encoded thymidine kinase, compete with the
nucleotides to inhibit the viral DNA polymerase and
subsequently cause the termination of growing viral DNA
chains (Field, 2001). Although these drugs are effective in the
treatment of many acute infections, the intensive use of
these drugs has led to the emergence of resistant viral strains,
mainly in immunocompromised patients (Field, 2001).
Therefore, there is a need to provide other drugs with
distinct mechanisms as alternatives to existing therapies.
Alkaline nuclease, which is encoded by the UL12 gene of
HSV-1, possesses both endonuclease and exonuclease activities
under alkaline pH conditions (Hoffmann and Cheng,
1978; McGeoch et al., 1986; Knopf and Weisshart, 1990).
Null mutants incapable of expressing UL12 are able to
synthesize near wild-type levels of viral DNA, suggesting that
UL12 is not essential for viral DNA replication in culture
Received 15 February 2008; revised 18 April 2008; accepted 7 May 2008;
published online 16 June 2008
Correspondence: Professor T-Y Ho, Graduate Institute of Chinese Medical
Science, China Medical University, 91 Hsueh-Shih Road, Taichung 40402,
Taiwan.
E-mail: [e-mail]
British Journal of Pharmacology (2008) 155, 227–235
& 2008 Macmillan Publishers Limited All rights reserved 0007–1188/08 $32.00
www.brjpharmacol.org
(Weller et al., 1991). Although UL12 is not essential for viral
DNA synthesis, UL12 mutant viral yields are 0.1–1% of wildtype
yields (Shao et al., 1993; Martinez et al., 1996a). The
analysis of UL12 null mutants has shown that the decrease in
virus yield results from the reduction of capsids exiting from
the nucleus (Martinez et al., 1996b; Goldstein and Weller,
1998). Analysis of replicating DNA from UL12 mutantinfected
cells has shown that UL12 is implicated in resolving
branched structures of HSV-1 replicative intermediates prior
to encapsidation (Martinez et al., 1996a; Porter and Stow,
2004a, b). Therefore, these results indicate that, even though
UL12 is not essential for either viral DNA synthesis or
packaging, UL12 is required for full efficiency of these
processes. Additionally, these findings suggest that HSV-1
UL12 can be a novel target for anti-herpes viral drugs.
Increasing the emergence of resistant viral strains has
highlighted the crucial need for the development of new
anti-herpes virus drugs with different mechanisms. Several
potential viral targets, such as helicase–primase complex and
DNA polymerase, have been known to be involved in HSV-1
infection and for which specific inhibitors with anti-HSV
activity, at least in cell cultures, have been identified (Crute
et al., 2002; Thomsen et al., 2003; Greco et al., 2007). In the
present study, we analysed the potent inhibitor of HSV-1 that
targeted viral UL12. Our findings indicated that emodin
(1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone), the naturally occurring
anthraquinone present in the root and bark of
numerous plants of the genera Rheum and Polygonum,
inhibited HSV-1 UL12 activity, leading to the accumulation
of nucleocapsids in the nucleus and the subsequent reduction
of HSV-1 yields in Vero cells.
Methods
Materials
All chemicals, except where indicated, were purchased from
Sigma (St Louis, MO, USA). Plant materials were purchased
from Sun Ten Pharmaceutical Corporation (Taipei, Taiwan).
Plant samples were ground to fine powders with homogenizers
and extracted with methanol, as described previously
(Chen et al., 2007a). Emodin and its analogues were
dissolved in dimethyl sulphoxide (DMSO). 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide (MTT)
was dissolved in phosphate-buffered saline (PBS) (137 mM
NaCl, 1.4 mM KH2PO4, 4.3 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, pH
7.2). Bovine pancreatic DNase I was purchased from New
England BioLabs (Beverly, MA, USA). Mouse anti-HSV-1
nucleocapsid protein monoclonal antibody and fluorescein
(FITC)-conjugated goat anti-mouse antibody were purchased
from USBiological (Swampscott, MA, USA) and Jackson
ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA, USA),
respectively.
Cells and viruses
African green monkey kidney cells (Vero cells), which were
purchased from Bioresource Collection and Research Center
(Hsinchu, Taiwan), were cultured in Dulbecco’s modified
Eagle’s medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) supplemented
with 10% foetal bovine serum (HyClone, Logan, UT, USA)
and grown at 37 1C in a humidified CO2 atmosphere.
Laboratory strain (KOS) of HSV-1 was used, and the viral
stock was prepared and titrated in Vero cells.
Cloning, expression and purification of recombinant HSV-1 UL12
To clone the HSV-1 UL12 gene, viral genomic DNA was
extracted from HSV-1-infected Vero cells as described previously
and amplified for 35 cycles with UL12-P (50
-TCG
GATCCATGGAGTCCACGGTAGGCCCAGC-30
) and UL12-M
(50
-CGAATTCGGTCAGCGAGACGACCTCCCCG-30
) primers
(Hsiang et al., 1996; Wu et al., 1998). The 1897-bp UL12 gene
fragment was inserted into EcoR I and BamH I sites of
histidine-tagged expression vector pET-28a( þ ) (Novagen,
Madison, WI, USA) to create the pET-UL12. Recombinant
UL12 protein was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3)
pLysS strain by transforming the pET-UL12 to produce an
N-terminal fusion with six histidine residues. The protein
was purified by affinity chromatography as described previously
(Hsiang et al., 1998; Ho et al., 2000). Purified protein
was analysed by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel
electrophoresis, quantified with a Bradford assay (Bio-Rad,
Hercules, CA, USA), and stored at 70 1C until further assays.
Nuclease activity assay
Plasmid pUC18 dsDNA, prepared by Qiagen Plasmid Midi Kit
(Qiagen, Valencia, CA, USA), was mixed with purified UL12
in DNase buffer (50 mM Tris-HCl, pH 9.0, 2 mM MgCl2,
10 mM 2-mercaptoethanol) and incubated at 37 1C. The
reaction was then stopped by the addition of stop solution
(25% glycerol, 0.5% sodium dodecyl sulphate, 0.05%
bromophenol blue, 50 mM EDTA), and the resulting products
were analysed by electrophoresis on 1.2% agarose gels. The
intensities of substrates on the gel were measured by Gel-Pro
Analyzer (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA).
Nuclease activity (%) was calculated by ((intensity of
untreated substrateintensity of nuclease-treated substrate)/intensity
of untreated substrate)  100%.
Plaque reduction assay
Plaque reduction assay was performed as described previously
with a slight modification (Hodinka et al., 2000). Cell
monolayers, cultured in 24-well culture plates, were infected
with 30 plaque-forming units (PFU) of HSV-1 for 1 h at room
temperature and subsequently for 30 min at 37 1C. The viruses
were then discarded, and the cells were overlaid with 1 mL of
1% methylcellulose medium containing emodin and incubated
at 37 1C in a humidified CO2 atmosphere. Three days
later, cells were fixed and stained by 0.5% crystal violet in 50%
methanol, and the number of plaques was counted (Hsiang
et al., 2001). EC50 value was determined as the quantity of
emodin required to reduce the plaque number by 50%.
MTT assay
Cell viability was monitored by MTT colorimetric assay as
described previously (Lee et al., 2007). Brie

Kết quả (Việt) 1:

NGHIÊN CỨU GIẤYEmodin là một chất ức chế nuclease kiềm cuốn tiểu thuyết màngăn chặn virus herpes simplex type 1 sản lượng trong tế bàonền văn hóaC-Y Hsiang1 và T-Y Ho21Vùng vi sinh vật học, đại học y khoa Trung Quốc, Taichung, Đài Loan và 2Học viện Khoa học y tế Trung Quốc,Đại học y khoa Trung Quốc, Taichung, Đài LoanNền và mục đích: hầu hết phương pháp điều trị kháng virus đạo diễn chống lại herpes simplex virus (HSV) nhiễm trùng được giới hạn trong một nhỏNhóm của nucleoside analogues nhắm mục tiêu polymerase virus. Sử dụng lâm sàng của các thuốc này đã dẫn tới sự nổi lênchống virus chủng, chủ yếu là ở những bệnh nhân immunocompromised. Điều này làm nổi bật sự cần thiết cho sự phát triển của mới antiherpesviralma túy với mục tiêu tiểu thuyết. Ở đây những ảnh hưởng của một nhà máy anthraquinone, emodin, nuclease kiềm HSV-1sản lượng hoạt động và virus đã được điều tra.Cách tiếp cận thực nghiệm: HSV-1 kiềm nuclease hoạt động được kiểm tra bởi nuclease hoạt động khảo nghiệm. Ức chế sản lượng virusđã được đo bởi mảng bám giảm khảo nghiệm và immunohistochemical nhuộm. Tương tác giữa emodin và kiềmnuclease được phân tích bởi lắp ghép công nghệ.Chính kết quả: Emodin cụ thể ức chế hoạt động nuclease của HSV-1 UL12 nuclease kiềm trong một khảo nghiệm sinh hóa. Mảng bámkhảo nghiệm giảm tiết lộ rằng emodin giảm sự hình thành mảng bám với một EC50 21.5±4.4 mm. Immunohistochemicalnhuộm bằng cách sử dụng kháng thể chống nucleocapsid protein đã chứng minh rằng emodin gây ra sự tích tụ của virusnucleocapsids trong hạt nhân một cách phụ thuộc vào liều. Ổ cắm cho phân tích tiếp tục đề nghị mà ức chế tác dụngcủa emodin trên UL12 hoạt động có thể dẫn từ sự tương tác giữa emodin và dư lượng axít amin quan trọng tác dụng xúc tác củaUL12.Kết luận và ý nghĩa: những phát hiện của chúng tôi đề nghị emodin đó là một đại lý mạnh chống-HSV ức chế sản lượng của HSV-1thông qua sự đàn áp của một mục tiêu tiểu thuyết, UL12.Các tạp chí Anh khoa dược lý học (2008) 155, 227-235; Doi:10.1038/BJP.2008.242; xuất bản trực tuyến ngày 16 tháng 6 năm 2008Từ khóa: herpes simplex virus loại 1; emodin; kiềm nucleaseChữ viết tắt: CK2, casein kinase 2; DMSO, Dimetyl sulphoxide; FITC, fluorescein; HSV, virus herpes simplex; MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) - 2,5 - diphenyltetrazolium bromua; PBS, dung dịch muối đệm phosphat; PFU, hình thành các mảng bámđơn vịGiới thiệuVirus herpes simplex (HSV) gây ra mụn rộp labialis, herpesviêm, herpes di truyền và viêm não herpes đe dọa cuộc sống.Nhiễm trùng HSV là nghiêm trọng hơn trong immunocompromisedbệnh nhân, mà được đặc trưng bởi mãn tính vàtổn thương sâu rộng của màng nhầy (Whitley, 2001).Hầu hết các phương pháp điều trị đạo diễn chống lại nhiễm trùng HSV là nucleotide,nucleosides hoặc pyrophotphat analogues, chẳng hạn nhưacyclovir, valacyclovir, penciclovir và famciclovir. Sau khihấp thụ bởi các tế bào nhiễm virus, các loại thuốc này được phosphorylatedbởi virus mã hóa thymidine kinase, cạnh tranh với cácnucleotide ức chế virus ADN polymerase vàsau đó gây ra việc chấm dứt của phát triển virus ADNdây chuyền (Field, 2001). Mặc dù các loại thuốc có hiệu quả trong cácđiều trị nhiều bệnh nhiễm trùng cấp tính, việc sử dụng chuyên sâuCác thuốc này đã dẫn tới sự nổi lên của các chủng kháng viruschủ yếu là ở những bệnh nhân immunocompromised (Field, 2001).Vì vậy, có là một nhu cầu để cung cấp các loại thuốc khác vớiCác cơ chế khác nhau như là lựa chọn thay thế cho phương pháp điều trị hiện tại.Kiềm nuclease, được mã hóa bởi gen UL12 củaHSV-1, có hoạt động cả hai endonuclease và exonucleasetrong điều kiện kiềm pH (Hoffmann và Cheng,1978; McGeoch et al., 1986; Knopf và Weisshart, 1990).Null người đột biến không có khả năng thể hiện UL12 có thểTổng hợp gần loại hoang cấp virus ADN, gợi ý rằngUL12 không phải là điều cần thiết cho virus ADN nhân rộng trong văn hóaNhận được 15 tháng 2 năm 2008; Sửa đổi 18 tháng tư 2008; chấp nhận 7 tháng 5 năm 2008.xuất bản trực tuyến ngày 16 tháng 6 năm 2008Thư từ: Giáo sư T-Y hồ, tốt nghiệp học viện y tế Trung QuốcĐại học y tế khoa học, Trung Quốc, 91 Hsueh-Shih Road, Taichung 40402,Đài Loan.Thư điện tử: [e-mail]ác tạp chí Anh khoa dược lý học (2008) 155, 227-235& 2008 Macmillan nhà xuất bản giới hạn tất cả các quyền 0007-1188/08 $32,00www.brjpharmacol.org(Weller et al., 1991). Mặc dù UL12 không phải là điều cần thiết cho virusTổng hợp DNA, UL12 đột biến virus sản lượng là 0.1-1% của wildtypesản lượng (Shao et al., 1993; Martinez et al., 1996a). Cácphân tích của người đột biến null UL12 đã chỉ ra rằng việc giảmvi rút mang lại kết quả từ việc giảm capsids thoát từhạt nhân (Martinez et al., 1996b; Goldstein và Weller,Năm 1998). phân tích của sao chép DNA từ UL12 mutantinfectedtế bào đã cho thấy rằng UL12 liên quan đến giải quyếtphân nhánh cấu trúc của HSV-1 replicative trung gian trướcđể encapsidation (Martinez et al., 1996a; Porter và Stow,2004a, b). Do đó, các kết quả này chỉ ra rằng, ngay cả khiUL12 không phải là điều cần thiết cho một trong hai tổng hợp DNA virus hoặcbao bì, UL12 được yêu cầu cho các hiệu quả đầy đủ cácquy trình. Ngoài ra, những phát hiện này gợi ý rằng HSV-1UL12 có thể là một mục tiêu mới lạ cho herpes chống virus thuốc.Tăng sự xuất hiện của các chủng kháng virus cónêu bật sự cần thiết quan trọng cho sự phát triển mớivirus herpes chống thuốc với cơ chế khác nhau. Một sốmục tiêu tiềm năng, virus, chẳng hạn như helicase-primase phức tạp vàDNA polymerase, đã được biết là được tham gia vào HSV-1nhiễm trùng và cho đó ức chế cụ thể với anti-HSVhoạt động, tối thiểu trong nền văn hóa tế bào, đã xác định (Cruteet al., 2002; Thomsen et al., 2003; Vương quốc Hy Lạp et al., 2007). Trong cáctrình bày nghiên cứu, chúng tôi phân tích chất ức chế mạnh của HSV-1 mànhắm mục tiêu UL12 virus. Những phát hiện của chúng tôi chỉ ra rằng emodin(1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone), các nguồn gốc tự nhiênanthraquinone hiện diện trong rễ và vỏnhiều loài trong các chi Rheum và Polygonum,inhibited HSV-1 UL12 hoạt động, dẫn đến sự tích tụcủa nucleocapsids trong hạt nhân và việc giảm tiếp theocủa HSV-1 các sản lượng trong các tế bào Vero.Phương phápVật liệuHóa chất tất cả, ngoại trừ trường hợp được chỉ định, đã được mua từSigma (St Louis, MO, Mỹ). Vật liệu thực vật được muatừ Sun mười công ty cổ phần dược phẩm (Đài Bắc, Đài Loan).Thực vật mẫu là mặt đất để tinh bột với Translationvà chiết xuất với methanol, như mô tả trước đó(Chen et al., 2007a). Emodin và analogues của nó đãgiải tán năm Dimetyl sulphoxide (DMSO). 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazoliumbromua (MTT)được hòa tan trong dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (137 mMNaCl, 1.4 mM KH2PO4, 4.3 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, độ pH7.2). bò DNase tuyến tụy, tôi đã được mua từ NewEngland BioLabs (Beverly, MA, USA). Chuột chống-HSV-1nucleocapsid protein monoclonal kháng và fluorescein(FITC)-ngoại dê chống chuột kháng thể đã được muatừ USBiological (Swampscott, MA, USA) và JacksonImmunoResearch phòng thí nghiệm (West Grove, PA, Mỹ),tương ứng.Tế bào và vi rútChâu Phi xanh khỉ thận tế bào (Vero tế bào), mà đãmua từ Bioresource bộ sưu tập và Trung tâm nghiên cứu(Tân trúc, Đài Loan), được nuôi cấy trong Dulbecco của lầnEagle của phương tiện (Gibco, Carlsbad, California, Hoa Kỳ) bổ sungvới 10% thai nhi huyết thanh bò (HyClone, Logan, UT, Mỹ)và trồng lúc 37 1 c trong một bầu không khí CO2 ẩm.Phòng thí nghiệm chủng (KOS) của HSV-1 được sử dụng, và các viruschứng khoán được chuẩn bị sẵn sàng và chuẩn độ trong tế bào Vero.Nhân bản, biểu hiện và thanh lọc của tái tổ hợp HSV-1 UL12Để sao chép các gen HSV-1 UL12, virus gen DNA làchiết xuất từ tế bào nhiễm bệnh HSV-1 Vero như mô tả trước đóvà khuếch đại trong các chu kỳ 35 với UL12-P (50-TCGGATCCATGGAGTCCACGGTAGGCCCAGC-30) và UL12-M(50-CGAATTCGGTCAGCGAGACGACCTCCCCG-30) lớp lót(Hsiang et al., 1996; Ngô và ctv, 1998). 1897-bp UL12 genmảnh đã được đưa vào vào EcoR tôi và BamH tôi các trang web củadán histidine biểu hiện vector thú cưng-28a (þ) (Novagen,Madison, WI, Mỹ) để tạo ra vật nuôi-UL12. Tái tổ hợpUL12 protein được thể hiện trong Escherichia coli BL21 (DE3)pLysS căng thẳng bằng cách chuyển đổi UL12 vật nuôi để sản xuất mộtPhản ứng tổng hợp N-ga với sáu histidine dư lượng. Proteinđược tinh chế bằng sắc kí ái lực như mô tả trước đó(Hsiang et al., 1998; Hồ et al., 2000). Tinh khiết proteinđược phân tích bằng natri dodecyl sunfat-polyacrylamide gelđiện, định lượng với một khảo nghiệm Bradford (Bio-Rad,Hercules, CA, Hoa Kỳ), và được lưu trữ tại 70 1 c cho đến khi tiếp tục thử nghiệm.Nuclease hoạt động khảo nghiệmPlasmid pUC18 dsDNA, chuẩn bị bởi Qiagen Plasmid Midi Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA), được trộn với tinh khiết UL12trong vùng đệm DNase (50 mM Tris-HCl, pH 9.0, 2 mM MgCl2,10 mM 2-mercaptoethanol) và ủ tại 37 1C. Cácphản ứng sau đó dừng lại bằng cách bổ sung dừng giải pháp(25% glyxêrin, 0,5% natri dodecyl sunfat, 0,05%bromophenol xanh, 50 mM EDTA), và các sản phẩm kết quảđã được phân tích bằng điện trên 1,2% agarose gel. Cáccường độ của các chất nền trên gel được đo bằng Gel-ProPhân tích (phương tiện truyền thông Cybernetics, Silver Spring, MD, Hoa Kỳ).Nuclease hoạt động (%) đã được tính toán bởi ((cường độ củakhông được điều trị substrateintensity nuclease xử lý bề mặt) / cường độcủa bề mặt không được điều trị) 100%.Mảng bám giảm khảo nghiệmMảng bám giảm khảo nghiệm được thực hiện như mô tả trước đóvới một sửa đổi chút ít (Hodinka và ctv., 2000). Di độngmonolayers, nuôi cấy trong văn hóa 24-cũng tấm, bị nhiễmvới 30 hình thành các mảng bám đơn vị (PFU) của HSV-1 cho 1 h tại Phòngnhiệt độ và sau đó trong 30 phút tại 37 1C. Các virussau đó đã được loại bỏ, và các tế bào được che với 1 mL1% methylcellulose trung bình có chứa emodin và ủtại 37 các 1 c trong một bầu không khí CO2 ẩm. Ba ngàysau đó, các tế bào đã được cố định và màu bởi 0,5% tinh thể màu tím trong 50%methanol, và số lượng các mảng được đếm (Hsianget al., 2001). EC50 giá trị đã được xác định là số lượngemodin cần thiết để giảm số mảng bám 50%.Khảo nghiệm MTTKhả năng di động đã được giám sát bởi MTT colorimetric khảo nghiệm nhưMô tả trước đó (Lee và ctv., 2007). Brie

Kết quả (Việt) 2:

NGHIÊN CỨU GIẤY
Emodin là một chất ức chế nuclease kiềm cuốn tiểu thuyết mà
ức chế herpes simplex virus type 1 sản lượng trong tế bào
nuôi cấy
CY Hsiang1 và TY Ho2
1
cục Microbiology, Đại học Y khoa Trung Quốc, Đài Trung, Đài Loan và 2
tốt nghiệp Viện Khoa học Y khoa Trung Quốc,
Đại học Y khoa Trung Quốc, Taichung, Đài Loan
Bối cảnh và mục đích: Hầu hết các liệu pháp kháng virus chống lại virus herpes simplex (HSV) nhiễm trùng được giới hạn trong một nhỏ
nhóm các chất tương tự nucleoside nhắm polymerase của virus. Sử dụng lâm sàng rộng rãi của các loại thuốc này đã dẫn đến sự xuất hiện
của các chủng virus kháng thuốc, chủ yếu là ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Điều này nhấn mạnh sự cần thiết cho sự phát triển của antiherpesviral mới
loại thuốc với mục tiêu mới. Ở đây các tác động của một nhà máy anthraquinone, emodin, trên HSV-1 nuclease kiềm
hoạt động và vi rút sản lượng đã được nghiên cứu.
Phương pháp thực nghiệm: HSV-1 hoạt động nuclease kiềm đã được kiểm tra bởi các hoạt động nuclease khảo nghiệm. Sự ức chế sản lượng vi rút
được đo bằng xét nghiệm giảm mảng bám và nhuộm hóa mô miễn dịch. Sự tương tác giữa emodin và kiềm
nuclease được phân tích bằng cách lắp ghép công nghệ.
Các kết quả chính: Emodin cụ thể ức chế hoạt động nuclease của HSV-1 UL12 nuclease kiềm trong một khảo nghiệm sinh hóa. Mảng bám
khảo nghiệm giảm tiết lộ rằng emodin giảm sự hình thành mảng bám với một EC50 21,5 ± 4,4 mM. Miễn dịch
nhuộm sử dụng các kháng thể protein chống nucleocapsid chứng minh rằng emodin gây ra sự tích tụ của virus
nucleocapsids trong hạt nhân một cách phụ thuộc vào liều. Phân tích Docking thêm gợi ý rằng tác dụng ức chế
của emodin trên hoạt động UL12 có thể là kết quả của sự tương tác giữa emodin và quan trọng xúc tác dư lượng axit amin của
UL12.
Kết luận và ý nghĩa: những phát hiện của chúng tôi cho thấy rằng emodin là một tác nhân chống HSV mạnh ức chế sự sản lượng HSV-1
qua sự đàn áp của một mục tiêu mới, UL12.
British Journal of Pharmacology (2008) 155, 227-235; doi: 10,1038 / bjp.2008.242; công bố trực tuyến ngày 16 Tháng 6 2008
Từ khóa: herpes simplex virus type 1; emodin; kiềm nuclease
Chữ viết tắt: CK2, casein kinase 2; DMSO, dimethyl sulphoxide; FITC, fluorescein; HSV, virus herpes simplex; MTT, 3- (4,5-
dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide; PBS, đệm phosphat nước muối; PFU, mảng bám hình thành
đơn vị
Giới thiệu
Herpes simplex virus (HSV) gây ra herpes rộp môi, herpes
viêm giác mạc, herpes di truyền và đe dọa tính mạng herpes viêm não.
Nhiễm HSV là nghiêm trọng hơn trong suy giảm miễn dịch
bệnh nhân, được đặc trưng bởi mãn tính và
tổn thương rộng lớn của các màng nhầy (Whitley, 2001).
Hầu hết các liệu pháp chống lại nhiễm HSV là nucleotide,
nucleoside hoặc tương tự pyrophosphate, như
acyclovir, valacyclovir, famciclovir và penciclovir. Sau khi
hấp thu của tế bào nhiễm virus, các loại thuốc này được phosphoryl hóa
bởi virus mã hóa thymidine kinase, cạnh tranh với các
nucleotide để ức chế polymerase DNA của virus và
sau đó gây ra việc chấm dứt phát triển DNA virus
chuỗi (Field, 2001). Mặc dù các thuốc này có hiệu quả trong
điều trị nhiều bệnh nhiễm trùng cấp tính, sử dụng chuyên sâu của
các loại thuốc này đã dẫn đến sự xuất hiện của chủng virus kháng thuốc,
chủ yếu là ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch (Field, 2001).
Do đó, có một nhu cầu để cung cấp các loại thuốc khác với
. cơ chế riêng biệt nhằm thay thế cho phương pháp điều trị hiện có
nuclease Alkaline, được mã hóa bởi gene UL12 của
HSV-1, sở hữu cả hai hoạt động endonuclease và exonuclease
trong điều kiện pH kiềm (Hoffmann và Cheng,
1978;. McGeoch et al, 1986; Knopf và Weisshart ., 1990)
đột biến Null không có khả năng thể hiện UL12 có thể
tổng hợp gần mức hoang dại của DNA của virus, cho thấy rằng
UL12 là không cần thiết cho sự sao chép DNA của virus trong văn hóa
nhận 15 tháng 2 2008; sửa đổi ngày 18 tháng tư năm 2008; chấp nhận 7 tháng 5 năm 2008;
công bố trực tuyến ngày 16 tháng 6 năm 2008
Correspondence: Giáo sư TY Ho, Viện Y khoa Trung Quốc
Khoa học, Đại học Y khoa Trung Quốc, 91 Hsueh-Shih Road, Taichung 40.402,
Đài Loan.
E-mail: [e-mail]. tw
British Journal of Pharmacology (2008) 155, 227-235
& 2008 Nhà xuất bản Macmillan TNHH Tất cả các quyền 0007-1188 / 08 32.00 $
www.brjpharmacol.org
(Weller et al., 1991). Mặc dù UL12 là không cần thiết cho virus
tổng hợp DNA, UL12 sản lượng virus đột biến là 0,1-1% trong hoang dã
năng suất (Shao et al, 1993;.. Martinez et al, 1996a). Các
phân tích của UL12 đột biến rỗng đã chỉ ra rằng việc giảm
kết quả sản lượng virus từ việc giảm capsid thoát ra từ
hạt nhân (Martinez et al, 1996;. Goldstein và Weller,
1998). Phân tích của sao chép DNA từ UL12 mutantinfected
tế bào đã chỉ ra rằng UL12 là liên quan đến việc giải quyết
các cấu trúc phân nhánh của HSV-1 nhân lên trung gian trước khi
đến encapsidation (Martinez et al, 1996a;. Porter và Stow,
2004a, b). Vì vậy, những kết quả này chỉ ra rằng, mặc dù
UL12 là không cần thiết cho một trong hai tổng hợp DNA của virus hoặc
bao bì, UL12 là cần thiết cho hiệu quả tối đa của các
quy trình. Ngoài ra, những phát hiện này cho thấy rằng HSV-1
UL12 có thể là một mục tiêu mới cho thuốc chống virus herpes.
Tăng sự xuất hiện của chủng virus kháng thuốc đã
nêu bật nhu cầu rất quan trọng cho việc phát triển mới
các loại thuốc chống vi rút herpes-với các cơ chế khác nhau. Một số
mục tiêu của virus tiềm năng, chẳng hạn như helicase-primase phức tạp và
DNA polymerase, đã được biết đến để được tham gia vào HSV-1
nhiễm trùng và cho đó ức chế cụ thể với anti-HSV
hoạt động, ít nhất là trong nuôi cấy tế bào, đã được xác định (Crute
et al ., 2002; Thomsen et al, 2003;.. Greco et al, 2007). Trong
nghiên cứu này, chúng tôi phân tích các chất ức chế mạnh của HSV-1 rằng
mục tiêu của virus UL12. Phát hiện của chúng tôi chỉ ra rằng emodin
(1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone), các tự nhiên
anthraquinon có trong rễ và vỏ cây của
nhiều nhà máy của các chi Rheum và Polygonum,
ức chế HSV-1 hoạt động UL12, dẫn đến sự tích tụ
của nucleocapsids trong hạt nhân và giảm tiếp theo
của HSV-1 sản lượng trong các tế bào Vero.
Phương pháp
Vật liệu
Tất cả các hóa chất, trừ khi có chỉ định, được mua từ
Sigma (St Louis, MO, USA). Nguyên liệu thực vật được mua
từ Sun Mười Tổng Công ty Dược (Đài Bắc, Đài Loan).
Mẫu cây được nghiền để bột mịn với pha trộn
và chiết với methanol, như được mô tả trước đây
(Chen et al., 2007a). Emodin và chất tương tự của nó đã được
hòa tan trong dimethyl sulphoxide (DMSO). 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium
bromide (MTT)
được hòa tan trong đệm phosphat mặn (PBS) (137 mM
NaCl, 1,4 mM KH2PO4, 4.3 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl, pH
7.2). DNase tụy bò tôi đã được mua từ New
England BioLabs (Beverly, MA, USA). Chuột chống HSV-1
protein nucleocapsid kháng thể đơn dòng và fluorescein
(FITC) -conjugated kháng thể anti-dê chuột đã được mua
từ USBiological (Swampscott, MA, USA) và Jackson
ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA, USA),
tương ứng.
Các tế bào và virus
tế bào thận khỉ xanh châu Phi (tế bào Vero), được
mua từ Bioresource Collection và Trung tâm Nghiên cứu
(Hsinchu, Đài Loan), được nuôi cấy trong sửa đổi Dulbecco
trung Eagle (Gibco, Carlsbad, CA, USA) bổ sung
với 10% huyết thanh bào thai bò ( HyClone, Logan, UT, USA)
và được trồng ở 37 1C trong một bầu không khí CO2 ẩm.
Phòng thí nghiệm biến dạng (KOS) của HSV-1 đã được sử dụng, và các virus
cổ phiếu đã được chuẩn bị và điều chỉnh liều trong các tế bào Vero.
Cloning, biểu hiện và tinh chế tái tổ hợp HSV-1 UL12
Để clone gen HSV-1 UL12, DNA hệ gen virus đã được
chiết xuất từ các tế bào Vero HSV-1 nhiễm như mô tả trước đây
và khuếch đại cho 35 chu kỳ với UL12-P (50
-TCG
GATCCATGGAGTCCACGGTAGGCCCAGC-30) và UL12-M (50 -CGAATTCGGTCAGCGAGACGACCTCCCCG-30) mồi (Hsiang et al., 1996; Wu et al., 1998). Năm 1897-bp gene UL12 mảnh được đưa vào EcoR I và BamH tôi trang web của vector biểu hiện histidine-tagged pET-28a (þ) (Novagen, Madison, WI, USA) để tạo ra các pET-UL12. Tái tổ hợp protein UL12 được thể hiện trong Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS căng thẳng bằng cách chuyển đổi các pET-UL12 để tạo ra một phản ứng tổng hợp N-terminal với sáu dư lượng histidine. Các protein được tinh chế bằng sắc ký ái lực như mô tả trước đây (Hsiang et al, 1998;. Hồ et al., 2000). Protein tinh khiết được phân tích bởi sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, định lượng với một khảo nghiệm Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), và bảo quản ở 70 1C cho đến khi xét nghiệm thêm. Nuclease khảo nghiệm hoạt động plasmid pUC18 dsDNA, chuẩn bị của Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), được trộn lẫn với tinh khiết UL12 trong DNase đệm (50 mM Tris-HCl, pH 9.0, 2 mM MgCl2, 10 mM 2-mercaptoethanol) và ủ ở 37 1C. Các phản ứng sau đó đã được ngừng lại bởi việc bổ sung các giải pháp ngăn chặn (25% glycerol, 0,5% sodium dodecyl sulfat, 0,05% bromophenol màu xanh, 50 mM EDTA), và các sản phẩm thu được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,2%. Các cường độ của cơ chất gel được đo bằng Gel-Pro Analyzer (Media khiển học, Silver Spring, MD, USA). Hoạt động nuclease (%) được tính bằng ((cường độ của substrateintensity chưa được xử lý bề mặt nuclease được điều trị) / cường độ không điều trị chất nền)? 100%. Giảm Plaque khảo nghiệm Plaque khảo nghiệm giảm được thực hiện như mô tả trước đây với một sửa đổi nhỏ (Hodinka et al., 2000). Tế bào đơn lớp, nuôi cấy trong đĩa nuôi cấy 24-tốt, đã bị nhiễm bệnh với 30 đơn vị mảng bám hình thành (PFU) của HSV-1 trong 1 giờ ở phòng nhiệt độ và sau đó trong 30 phút ở 37 1C. Các virus này sau đó được loại bỏ, và các tế bào được phủ lên bằng 1 ml 1% methylcellulose môi trường có chứa emodin và ủ ở 37 1C trong một bầu không khí CO2 ẩm. Ba ngày sau đó, các tế bào được cố định và nhuộm màu bằng 0,5% pha lê tím 50% methanol, và số lượng các mảng bám đã được đếm (Hsiang et al., 2001). Giá trị EC50 được xác định như số lượng emodin yêu cầu để giảm số lượng mảng bám bằng 50%. MTT khảo nghiệm khả năng di động đã được giám sát bởi MTT khảo nghiệm so màu như mô tả trước đây (Lee et al., 2007). Phô mai mềm của Pháp