Pronuclear DNA microinjectionThe fi

Pronuclear DNA microinjection
The first technique successfully used to produce transgenic pigs was DNA microinjection into pronuclei of zygotes [13, 14]. Generally, the efficiency of DNA microinjection is low. In addition, pronuclear DNA microinjection suffers from the fact that it may yield founder animals that are
654 J Mol Med (2010) 88:653–664
mosaic, and that random integration of the injected DNA fragments may cause varying expression levels due to position effects of the neighboring DNA or may disrupt functional endogenous sequences (insertional mutagenesis; reviewed in [4]). In spite of the overall low efficiency, probably most of the transgenic pig lines existing so far have been established by the pronuclear microinjection technique.
Sperm-mediated gene transfer
SMGT is based on the intrinsic ability of sperm to bind and internalize exogenous DNA and to transfer it into the egg during fertilization (reviewed in [15]). Although the efficiency of SMGT was discussed controversially after its first description in the mouse, SMGT in the pig was achieved by collection of sperm, incubation of sperm with exogenous DNA, and artificial insemination of gilts with DNA-loaded sperm. An important factor for the success of this method seems to be the selection of suitable sperm donor animals [16]. Linker-based sperm-mediated gene transfer is a variant of the procedure where the uptake of exogenous DNA by sperm cells is improved by receptormediated endocytosis of DNA–antibody complexes [17]. Another modification of SMGT is intracytoplasmic sperm injection-mediated gene transfer. The first step is the induction of sperm membrane damage (e.g., by freezethawing), followed by incubation with exogenous DNA, and finally intracytoplasmic injection of sperm with bound DNA into oocytes [18].
Lentiviral gene transfer
Lentiviruses belong to the family Retroviridae and transfer their RNA genome into infected cells, where it is reverse transcribed to DNA and integrated into the host genome as a so-called provirus which is transmitted in Mendelian manner to the offspring. Lentiviruses can transduce nondividing cells which allows immediate integration of the vector genome into the early embryo, reducing the risk of mosaic formation [19]. Lentiviral gene transfer was adapted to pigs [20, 21] and resulted in high proportions of transgenic offspring. Although lentiviral vector systems can only carry

Kết quả (Việt) 1:

Pronuclear DNA microinjectionCác kỹ thuật đầu tiên thành công được sử dụng để sản xuất biến đổi gen con lợn là DNA microinjection vào pronuclei của zygotes [13, 14]. Nói chung, hiệu quả của DNA microinjection là thấp. Ngoài ra, pronuclear DNA microinjection bị từ thực tế là nó có thể mang lại động vật sáng lập654 J Mol Med (2010) 88:653-664Mosaic, và rằng các tích hợp ngẫu nhiên của DNA tiêm mảnh có thể gây ra mức độ biểu hiện khác nhau do vị trí tác động của DNA giáp ranh hoặc có thể phá vỡ chức năng nội sinh chuỗi (insertional mutagenesis; xem xét trong [4]). Mặc dù hiệu quả nói chung thấp, có lẽ hầu hết các dòng biến đổi gen lợn sẵn có cho đến nay đã được thành lập bởi kỹ thuật pronuclear microinjection.Gen tinh trùng trung gian chuyển giaoSMGT dựa trên khả năng nội tại của tinh trùng để ràng buộc và trong lòng ngoại sinh DNA và chuyển nó vào trứng trong thụ tinh (xem xét trong [15]). Mặc dù hiệu quả của SMGT đã được thảo luận controversially sau khi mô tả đầu tiên của nó trong chuột, SMGT trong con lợn đạt được bằng bộ sưu tập của tinh trùng, ủ bệnh của tinh trùng với ADN ngoại sinh, và thụ tinh nhân tạo của gilts với DNA-nạp tinh trùng. Một yếu tố quan trọng cho sự thành công của phương pháp này có vẻ là lựa chọn của động vật nhà tài trợ tinh trùng phù hợp [16]. Dựa trên Linker trung gian tinh trùng gen chuyển là một biến thể của các thủ tục mà sự hấp thu của DNA ngoại sinh bởi các tế bào tinh trùng được cải thiện bởi receptormediated endocytosis của tổ hợp DNA-kháng thể [17]. Một sửa đổi của SMGT là tinh trùng intracytoplasmic tiêm trung gian gen chuyển. Bước đầu tiên là cảm ứng của thiệt hại màng tế bào tinh trùng (ví dụ:, bởi freezethawing), theo sau là ấp trứng với DNA ngoại sinh, và cuối cùng intracytoplasmic tiêm tinh trùng với ADN bị ràng buộc vào oocytes [18].Lentiviral gen chuyểnLentiviruses thuộc về gia đình Retroviridae và chuyển của RNA gen vào các tế bào bị nhiễm bệnh, nơi nó là đảo ngược phiên âm để DNA và tích hợp vào bộ gen máy chủ lưu trữ là một provirus cái gọi là được truyền theo Mendelian để con đẻ. Lentiviruses có thể transduce nondividing tế bào cho phép ngay lập tức hội nhập của bộ gen vector vào đầu phôi thai, giảm nguy cơ khảm hình thành [19]. Lentiviral gen chuyển được thích nghi với lợn [20, 21] và kết quả là các tỷ lệ cao của biến đổi gen con cái. Mặc dù hệ thống lentiviral vector chỉ có thể mang < 10 kb DNA ngoại sinh, điều này được coi là đủ cho chuyển của vectơ biểu hiện cho cDNAs và nhỏ can thiệp Rnas và Bắc Ireland. Như trình tự định vector thường có thể im lặng biểu sinh bởi DNA methylation, nó là quan trọng để điều tra hiện tượng này trong biến đổi gen con lợn chứa chấp lentiviral integrants. Nghiên cứu của chúng tôi tiết lộ đó-sau khi tách ra để thế hệ G1 — một phần ba của lentiviral integrants trưng bày các cấp thấp biểu hiện và hypermethylation [22], trong khi hai phần ba của lentiviral integrants đã thể hiện một cách trung thực thông qua các thế hệ tiếp theo. Vì vậy, lentiviral transgenesis rõ ràng là một thay thế hấp dẫn cho các kỹ thuật pronuclear microinjection.Tế bào Soma hạt nhân chuyểnKể từ khi thành công SCNT giao thức có sẵn cho lợn [23-25], công nghệ này là một tuyến đường hấp dẫn cho di truyềnHình 1 kỹ thuật hiện tại để sửa đổi di truyền của con lợn bao gồm DNA microinjection vào pronuclei của thụ tinh oocytes (DNA-MI), chuyển giao cho gen spermmediated (SMGT), lentiviral transgenesis (LV-GT), và tế bào Soma hạt nhân chuyển sử dụng biến đổi nhà tài trợ hạt nhân tế bào (SCNT). LV-GT có thể được thực hiện bởi subzonal tiêm của virus hạt vào oocytes trước hoặc sau khi thụ tinh. Một biến thể của SMGT là intracytoplasmic tiêm (ICSI) của tinh trùng đông lạnh-xả đá sau khi ủ bệnh ADN (xem các văn bản cho biết thêm chi tiết)J Mol Med (2010) 88:653-664 655Sửa đổi của loài này. Nói chung, transgenesis bởi SCNT bao gồm các bước sau đây: (1) sửa đổi di truyền và tuyển chọn các nhà tài trợ các tế bào trong văn hóa; (2) phục hồi và enucleation tại vivo hay trong ống nghiệm trưởng thành oocytes (metaphase II); (3) hạt nhân chuyển bởi electrofusion hoặc piezo-actuated microinjection (ít phổ biến hơn) và kích hoạt; (4) văn hóa trong ống nghiệm của phôi dựng lại; và (5) chuyển phôi để đồng bộ hóa người nhận. Các cải tiến khác nhau như "thủ công nhân bản" được phát triển để đơn giản hóa SCNT ở lợn [26]. SCNT cho đến nay là tuyến đường duy nhất để giới thiệu các đột biến được nhắm mục tiêu vào bộ gen con lợn. Via gen tương đồng trong các nhà tài trợ hạt nhân tế bào, đột biến đã được giới thiệu trong alpha-1,3-galactosyltransferase (GGTA1) và xơ nang xuyên dẫn điều (CFTR) gen, và con cái sống đã được sinh ra sau SCNT bằng cách sử dụng các tế bào [27, 28]. Đặc điểm hấp dẫn khác bao gồm: không có thế hệ của bức tranh phenotypes và khả năng lựa chọn trước các nhà tài trợ các tế bào liên quan đến transgene biểu hiện hoặc giới tính. Hơn nữa, SCNT từ các hồ bơi biến đổi của tế bào nhà tài trợ tiếp theo lựa chọn của nhà tài trợ thích hợp bào thai hoặc con cái có thể được sử dụng để tăng tốc độ transgenesis ở lợn (hình 2). Hiệu quả của nhân bản ở lợn là vẫn còn tương đối thấp, khác nhau, giữa 0,5% và 5% con cái một chuyển giao SCNT phôi. Cũng như ở các loài khác, hiệu quả thấp của SCNT là do thất bại trong biểu sinh reprogramming (được nhận xét [29]).Biến đổi gen con lợn là mô hình cho bệnh của con ngườiSo với phòng thí nghiệm động vật gặm nhấm, thử nghiệm tiêu chuẩn hóa các mô hình động vật lớn là thấp, và chi phí và lao động là cao. Do đó, mô hình biến đổi gen con lợn đã được phát triển chủ yếu cho các khu vực quan trọng bệnh nơi các nghiên cứu translational trong các mô hình động vật gặm nhấm có sẵn được giới hạn bởi kích thước nhỏ và ngắn cuộc sống của họ hoặc nơi động vật gặm nhấm mô hình đầy đủ không phản ánh tương ứng bệnh phenotypes. Một bản tóm tắt của các mô hình xuất bản biến đổi gen lợn được cung cấp trong bảng 1. Đề cập đến các gen được mô tả trong bảng 1, dữ liệu protein amyloid tiền thân của protein (APP), huntingtin (HTT), rhodopsin (RHO), tế bào nội mô nitric oxide synthase (eNOS), CFTR, và hepatocyte yếu tố hạt nhân 1 alpha (HNF1A) có sẵn cho con người, lợn, và chuột (http:// www.uniprot.org; http://www.ensembl.org). Loài so sánh về orthologous protein được thực hiện bởi sự liên kết và hướng dẫn sử dụng thích ứng của các chuỗi axít amin trong BioEdit [30]. Cho ứng dụng, RHO, eNOS, CFTR, và HNF1A, các protein của con người thêm tương tự như orthologs lợn. Đối với HTT, protein của con người là tương tự như chuột ortholog. Tuy nhiên, các phân tích của số lặp đi lặp lại intragenic trinucleotide liên kết với, lặp lại thừa kếCác bệnh neurodegenerative con người cho thấy khu vực lặp lại trinucleotide hơn được bảo tồn trong điều khoản của lặp lại chiều dài giữa con người và con lợn hơn giữa con người và động vật gặm nhấm [31].Các bệnh neurodegenerativeAlzheimer là một bệnh thần kinh multifactorial và xuất hiện trong một số gia đình như là một rối loạn chi phối NST thường hiển thị sự khởi đầu của bệnh sau 40 năm. Đột biến gây bệnh được xác định trong protein amyloid tiền thân của gen (APP) dẫn đến gia tăng sản xuất của các mảnh vỡ khác biệt protein mà lần lượt kết quả trong đau thần kinh. Để phát triển một mô hình lợn cho của bệnh Alzheimer, lợn biến đổi gen đã được sản xuất bằng cách sử dụng con người thống trị đột biến allele APPsw chứa chấp hai axit amin trao đổi do hai trao đổi nucleotide giáp ranh đó đã được tìm thấy gây ra dịch bệnh Alzheimer. Theo nghiên cứu trước đây biến đổi gen chuột, một transgene 7.5 kb được xây dựng với một promoter 1-kb tiểu cầu, xuất phát yếu tố tăng trưởng-beta, intronic và exonic trình tự của các gen Phiên bản beta-globin, cDNA mã hóa đột biến allele APPsw, và SV40 polyadenylation đoạn. Sau khi ổn định sửa đổi di truyền của fibroblasts của giống minipig Göttingen, một biến đổi gen di động bản sao được sử dụng cho SCNT để sản xuất con lợn bảy khỏe mạnh nhân bản biến đổi gen với trọng lượng bình thường đạt được. Những con lợn biến đổi gen harbored một bản sao đầy đủ độ dài duy nhất của transgene trong bộ gen của họ và cho thấy mạnh mẽ, promoterspecific biểu hiện của biến đổi gen protein trong não mô. Tích lũy của protein gây bệnh và các hình thức tiếp theo của hậu quả lâm sàng được ước tính để phát triển với sự gia tăng tuổi [32]. Huntington bệnh là một rối loạn neurodegenerative tiến bộ, chi phối NST thường liên quan đến sớm rụng của tế bào thần kinh cụ thể. Nó được kết hợp với một sự mở rộng của một trinucleotide CAG lặp lại trong vùng 5 ' gen huntingtin (HTT) mà kết quả trong một đường kéo dài polyglutamine của protein. CAG lặp lại số là bướu, khác nhau, từ 6 cho các đơn vị 35 trong allele bình thường và từ 36 đến 120 đơn vị trong alen liên kết với bệnh Huntington. Bảng điểm HTT 12.8-kb của Göttingen minipigs mã cho một protein 345-kDa (3.139 axit amin) [33]. 8.2-kb transgene được sử dụng cho DNA microinjection thành minipig phôi bao gồm 4-kb rat neuronspecific ôxy (Nse) promoter, một 3.3-kb 5 ′ minipig huntingtin cDNA mà đột biến bởi chèn của 75 CAG lặp đi lặp lại vào vùng bộ ba của exon 1, và một tín hiệu polyadenylation 0.9-kb SV40. Năm người sáng lập biến đổi gen con lợn đã được sản xuất mỗi chứa chấp một đến ba khác nhau tích hợp các trang web bản sao biến số và dấu hiệu của di truyền mosaicism [34]. Đến nay, không có xuất bản tiếp theo mô tả đột biến phenotypes xuất hiện.656 J Mol Med (2010) 88:653-664Retinitis pigmentosa (RP) thường gây ra đêm mù sớm trong cuộc sống do mất của rod photoreceptors. Nón photoreceptors còn lại từ từ làm suy thoái dẫn cuối cùng đến mù. Các gen khác nhau và các loci có liên kết với cácbệnh. Cả hai biến đổi gen và loại trực tiếp các mô hình động vật gặm nhấm võng mạc loạn dưỡng đã đóng góp cho các phân tích của bệnh. So với con người, động vật gặm nhấm mô hình được giới hạn bởi hai nhược điểm, số lượng nhỏ và phân bố khác nhauneopromoter mã hóa trình tự Expressing biến đổi gen lợnLựa chọn biểu hiện vectorTransfectionLựa chọn chuyển phôiHạt nhân chuyển tôiHạt nhân chuyển IIThành lập