1. Preparation of acellular layer:

1. Preparation of acellular layer: Mix the following reagents in a 50 mL tube on ice: 0.59 mL 10X EMEM, 50 μl 200mM L-glutamine, 0.6 mL FBS, 120 μl 7.5% Sodium bicarbonate and 4.6 mL bovine collagen I. Add 1 mL of the mixture into each insert of tissue culture trays. Incubate for 30 min at room temperature and allow the gel to solidify. Color of the mixture should be from straw-yellow to pink.
2. Trypsinize human fibroblasts from culture flasks with 0.25% trypsin/EDTA, add DMEM containing 10% FBS to neutralize. Collect cells by centrifugation and resuspend 0.45 x 106 cells in 1.5 mL DMEM with 10% FBS. For dermal stem cells, collect 6600 dermal spheres (when dermal stem cells grow in stem cell medium, they form spheres in a similar manner to neurospheres) by tapping flask to detach the spheres,
centrifugation.
3. Preparation of cellular layer: Mix the following in a 50 mL tube on ice: 1.65 mL 10X EMEM, 150 μl 200 mM L-glutamine, 1.85 mL FBS, 350 μl 7.5% Sodium bicarbonate, 14 mL bovine collagen I and 1.5 mL fibroblasts suspension from step 2 (alternatively, use combination of 0.45 x 106 fibroblasts and 6600 dermal spheres in 1.5 mL of skin reconstruct medium I for dermal stem cell reconstructs), mix well. Add 3 mL of the mixture to each acellular layer-coated insert. Incubate for 45 min at 37 °C in a 5 % CO2 tissue culture incubator. Color of the mixture should be from straw yellow to pink. After the gel solidifies, add DMEM containing 10% FBS (2 mL inside and 10 mL outside of insert in each well of skin reconstruct trays). Incubate for 4 days and make sure that the gel contracts.
4. Aspirate medium from both inside and outside of each insert. Add washing medium (HBSS with 1% dialyzed FBS) 2 mL to the inside and 10 mL to the outside of insert in order to wash off regular serum. Incubate for 1 hour at 37 °C.
5. Preparation of skin reconstruct medium:
1. For normal melanocyte and dermal stem cell reconstructs: To make basic medium (500 mL), mix the following reagents: 490 mL keratinocyte serum-free medium, 1.8 mL bovine pituitary extract, 10 mL dialyzed fetal bovine serum, 500 μl of 10 μg/mL SCF, 562.5 μl of 4 μg/mL bFGF and 500 μl of 264 μg/mL ET-3. Medium I: Add 10 μl EGF of 100 μg/mL to 100 mL basic medium. Medium II: Add 2 μl EGF to 100 mL basic medium. Medium III: Add 720 μl CaCl2 of 1 M to 300 mL basic medium.
2. For melanoma skin reconstruct: To make Medium I (100mL), mix the following reagents: 72.5 mL of DMEM, 24 mL of F12 (HAM's), 2
mL L-glutamine of 200 mM, 200 μl hydrocortisone of 269 μg/mL, 200 μl ITES of 500X, 200 μl O-phosphorylethanolamine of 0.05 M, 200 μl adenine of 90 mM, 200 μl Progesterone of 2 nM, 240 μl CaCl2 of 1 M, 200 μl Triiodothyronine of 10 nM and 100 μl of chelexed


newborn calf serum (dissolve 3 g of Chelex 100 in 100 mL of serum, stir 1.5 hours at 4 °C, filter sterilize). To make Medium II (100mL), mix the following reagents: 72.5 mL of DMEM, 24 mL of F12 (HAM's), 2 mL L-glutamine of 200 mM, 200 μl hydrocortisone of 269 μg/ mL, 200 μl ITES of 500X, 200 μl O-phosphorylethanolamine of 0.05 M, 200 μl adenine of 90 mM, 200 μl Progesterone of 2 nM, 240
μl CaCl2 of 1 M, 200 μl Triiodothyronine of 10 nM and 100 μl newborn calf serum. To make Medium III (300mL), mix the following reagents: 142.5 mL of DMEM, 142.5 mL of F12 (HAM's), 6 mL of L-glutamine of 200 mM, 600 μl hydrocortisone of 269 μg/mL, 600 μl ITES of 500X, 600 μl O-phosphorylethanolamine of 0.05 M, 600 μl adenine of 90 mM, 600 μl Progesterone of 2 nM, 720 μl CaCl2 of 1 M, 600 μl Triiodothyronine of 10 nM and 6 mL newborn calf serum.

6. Trypsinize human keratinocytes from culture flasks with 0.05% trypsin/EDTA, neutralize trypsin with soy bean trypsin inhibitor (250 mg/L in 1x phosphate buffered saline), spin down, resuspend a cell pellet at 4.17 x106 cells/mL in skin reconstruct medium I.
7. Trypsinize human melanocytes or melanoma cells from culture flasks with 0.05% trypsin/EDTA, neutralize trypsin with soy bean trypsin inhibitor, spin down, resuspend a cell pellet at 0.83 x106 cells/mL in skin reconstruct medium I.
8. Remove washing medium from both inside and outside of each insert.
9. Add skin reconstruct medium I (1.5 mL to the inside and 10 mL to the outside of each insert).
10. Take 600 μl cell suspension of keratinocytes and 600 μl cell suspension of melanocytes or melanoma cells, mix well. Dispense 200 μl mixed cell suspension drop by drop to the inside of each insert. For dermal stem cell reconstruct, use 100 μl of keratinocyte suspension only. Incubate for 2 days at 37 °C.
11. Aspirate skin reconstruct medium I from both the inside and the outside of each insert. Add skin reconstruct medium II (2 mL to the inside and 10 mL to the outside). Incubate for another 2 days at 37 °C.
12. Aspirate skin reconstruct medium II from the inside and the outside of each insert, add 7.5 mL skin reconstruct medium III to only the outside. From this point, the surface of reconstructs starts being exposed to

Kết quả (Việt) 1:

1. chuẩn bị của acellular lớp: pha trộn các chất sau đây trong một ống 50 mL trên băng: 0,59 mL 10 X EMEM, 50 μl 200mM L-glutamine, cách 0.6 mL FBS, 120 μl 7,5% natri bicarbonate và 4,6 mL bò collagen I. thêm 1 mL hỗn hợp vào mỗi chèn Khay đựng mô nền văn hóa. Ấp cho nở trong 30 phút ở nhiệt độ phòng và cho phép các gel để củng cố. Màu sắc của hỗn hợp cần từ rơm-màu vàng hồng.2. trypsinize fibroblasts của con người từ văn hóa bình với trypsin 0,25% / EDTA, thêm DMEM có chứa 10% FBS để vô hiệu hóa. Thu thập các tế bào bằng số và resuspend 0,45 x 106 các tế bào trong 1.5 mL DMEM với 10% FBS. Cho da tế bào gốc, thu thập các lĩnh vực biểu bì 6600 (khi da tế bào gốc phát triển trong môi trường tế bào gốc, chúng tạo thành các lĩnh vực trong một cách tương tự như để neurospheres) bằng cách khai thác bình để tách các lĩnh vực,số.3. Preparation of cellular layer: Mix the following in a 50 mL tube on ice: 1.65 mL 10X EMEM, 150 μl 200 mM L-glutamine, 1.85 mL FBS, 350 μl 7.5% Sodium bicarbonate, 14 mL bovine collagen I and 1.5 mL fibroblasts suspension from step 2 (alternatively, use combination of 0.45 x 106 fibroblasts and 6600 dermal spheres in 1.5 mL of skin reconstruct medium I for dermal stem cell reconstructs), mix well. Add 3 mL of the mixture to each acellular layer-coated insert. Incubate for 45 min at 37 °C in a 5 % CO2 tissue culture incubator. Color of the mixture should be from straw yellow to pink. After the gel solidifies, add DMEM containing 10% FBS (2 mL inside and 10 mL outside of insert in each well of skin reconstruct trays). Incubate for 4 days and make sure that the gel contracts.4. Aspirate medium from both inside and outside of each insert. Add washing medium (HBSS with 1% dialyzed FBS) 2 mL to the inside and 10 mL to the outside of insert in order to wash off regular serum. Incubate for 1 hour at 37 °C.5. Preparation of skin reconstruct medium:1. For normal melanocyte and dermal stem cell reconstructs: To make basic medium (500 mL), mix the following reagents: 490 mL keratinocyte serum-free medium, 1.8 mL bovine pituitary extract, 10 mL dialyzed fetal bovine serum, 500 μl of 10 μg/mL SCF, 562.5 μl of 4 μg/mL bFGF and 500 μl of 264 μg/mL ET-3. Medium I: Add 10 μl EGF of 100 μg/mL to 100 mL basic medium. Medium II: Add 2 μl EGF to 100 mL basic medium. Medium III: Add 720 μl CaCl2 of 1 M to 300 mL basic medium.2. For melanoma skin reconstruct: To make Medium I (100mL), mix the following reagents: 72.5 mL of DMEM, 24 mL of F12 (HAM's), 2mL L-glutamine of 200 mM, 200 μl hydrocortisone of 269 μg/mL, 200 μl ITES of 500X, 200 μl O-phosphorylethanolamine of 0.05 M, 200 μl adenine of 90 mM, 200 μl Progesterone of 2 nM, 240 μl CaCl2 of 1 M, 200 μl Triiodothyronine of 10 nM and 100 μl of chelexed newborn calf serum (dissolve 3 g of Chelex 100 in 100 mL of serum, stir 1.5 hours at 4 °C, filter sterilize). To make Medium II (100mL), mix the following reagents: 72.5 mL of DMEM, 24 mL of F12 (HAM's), 2 mL L-glutamine of 200 mM, 200 μl hydrocortisone of 269 μg/ mL, 200 μl ITES of 500X, 200 μl O-phosphorylethanolamine of 0.05 M, 200 μl adenine of 90 mM, 200 μl Progesterone of 2 nM, 240μl CaCl2 of 1 M, 200 μl Triiodothyronine of 10 nM and 100 μl newborn calf serum. To make Medium III (300mL), mix the following reagents: 142.5 mL of DMEM, 142.5 mL of F12 (HAM's), 6 mL of L-glutamine of 200 mM, 600 μl hydrocortisone of 269 μg/mL, 600 μl ITES of 500X, 600 μl O-phosphorylethanolamine of 0.05 M, 600 μl adenine of 90 mM, 600 μl Progesterone of 2 nM, 720 μl CaCl2 of 1 M, 600 μl Triiodothyronine of 10 nM and 6 mL newborn calf serum.6. Trypsinize human keratinocytes from culture flasks with 0.05% trypsin/EDTA, neutralize trypsin with soy bean trypsin inhibitor (250 mg/L in 1x phosphate buffered saline), spin down, resuspend a cell pellet at 4.17 x106 cells/mL in skin reconstruct medium I.7. Trypsinize human melanocytes or melanoma cells from culture flasks with 0.05% trypsin/EDTA, neutralize trypsin with soy bean trypsin inhibitor, spin down, resuspend a cell pellet at 0.83 x106 cells/mL in skin reconstruct medium I.8. Remove washing medium from both inside and outside of each insert.9. Add skin reconstruct medium I (1.5 mL to the inside and 10 mL to the outside of each insert).10. Take 600 μl cell suspension of keratinocytes and 600 μl cell suspension of melanocytes or melanoma cells, mix well. Dispense 200 μl mixed cell suspension drop by drop to the inside of each insert. For dermal stem cell reconstruct, use 100 μl of keratinocyte suspension only. Incubate for 2 days at 37 °C.11. Aspirate skin reconstruct medium I from both the inside and the outside of each insert. Add skin reconstruct medium II (2 mL to the inside and 10 mL to the outside). Incubate for another 2 days at 37 °C.12. Aspirate skin reconstruct medium II from the inside and the outside of each insert, add 7.5 mL skin reconstruct medium III to only the outside. From this point, the surface of reconstructs starts being exposed to

Kết quả (Việt) 2:

1. Chuẩn bị của lớp vô bào: Trộn các thuốc thử sau đây trong một ml ống 50 trên băng: 0,59 mL 10X EMEM, 50 ml 200mm L-glutamine, 0,6 ml FBS, 120 ml 7,5% Sodium bicarbonate và 4,6 mL bò collagen I. Thêm 1 ml hỗn hợp vào mỗi chèn khay nuôi cấy mô. Ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng và cho phép các gel để củng cố. Màu của hỗn hợp nên từ rơm màu vàng sang màu hồng.
2. Trypsinize nguyên bào sợi người từ bình nuôi cấy với 0,25% trypsin / EDTA, thêm DMEM có chứa 10% FBS để trung hòa. Thu thập các tế bào bằng cách ly tâm và resuspend 0,45 x 106 tế bào trong 1,5 ml DMEM 10% FBS. Đối với các tế bào gốc da, thu thập 6600 lĩnh vực da (khi tế bào gốc da phát triển trong môi trường tế bào gốc, chúng tạo thành hình cầu trong một cách tương tự như neurospheres) bằng cách khai thác bình để tách các quả cầu,
ly tâm.
3. Chuẩn bị của lớp tế bào: Trộn sau đây trong một ml ống 50 trên băng: 1,65 mL 10X EMEM, 150 ml 200 mM L-glutamine, 1,85 mL FBS, 350 ml 7,5% Sodium bicarbonate, 14 ml bò collagen I và 1,5 nguyên bào sợi mL treo từ bước 2 (cách khác, sử dụng sự kết hợp của 0,45 x 106 nguyên bào sợi và 6600 lĩnh vực da trong 1,5 ml da tái tạo lại môi tôi cho tế bào gốc da dựng lại), trộn đều. Thêm 3 ml hỗn hợp để chèn mỗi lớp bọc vô bào. Ủ trong 45 phút ở 37 ° C trong một lồng ấp văn hóa 5% mô CO2. Màu của hỗn hợp nên từ rơm màu vàng sang màu hồng. Sau khi rắn lại gel, thêm DMEM có chứa 10% FBS (2 mL bên trong và 10 mL ngoài chèn trong mỗi giếng của da tái tạo lại khay). Ủ trong 4 ngày và đảm bảo rằng các hợp đồng gel.
4. Hút trung bình từ cả bên trong và bên ngoài của mỗi chèn. Thêm môi trường rửa (HBSS với 1% dialyzed FBS) 2 mL vào bên trong và 10 ml đến bên ngoài chèn để rửa sạch huyết thanh thường xuyên. Ủ trong 1 giờ ở 37 ° C.
5. Chuẩn bị các phương tiện tái tạo lại làn da:
1. Đối với melanocyte bình thường và tế bào gốc da tái dựng: Để làm vừa cơ bản (500 ml), trộn các thuốc thử sau: 490 ml keratinocyte huyết thanh trung bình, 1,8 ml yên bò extract, 10 ml thẩm tách huyết thanh bào thai bò, 500 ml 10 mg / mL SCF, 562,5 ml 4 mg / ml bFGF và 500 ml 264 mg / mL ET-3. Medium I: Thêm 10 ml EGF 100 microgam / ml đến 100 ml môi trường cơ bản. Medium II: Thêm 2 ml EGF đến 100 mL vừa cơ bản. Medium III: Thêm 720 ml CaCl2 của 1 M đến 300 mL vừa cơ bản.
2. Để tái tạo lại làn da melanoma: Để làm vừa I (100mL), trộn các thuốc thử sau: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM) thì 2
mL L-glutamine 200 mM, 200 ml hydrocortisone 269 mg / ml, 200 ml ITES của 500X, 200 ml O-phosphorylethanolamine 0,05 M, 200 ml adenine 90 mM, 200 ml Progesterone của 2 nM, 240 ml CaCl2 của 1 M, 200 ml Triiodothyronine 10 nM và 100 ml chelexed


huyết thanh bê sơ sinh ( hòa tan 3 g Chelex 100 trong 100 mL huyết thanh, khuấy động 1,5 giờ ở 4 ° C, lọc khử trùng). Để làm vừa II (100ml), trộn các thuốc thử sau: 72,5 ml DMEM, 24 ml F12 (HAM) thì 2 mL L-glutamine 200 mM, 200 ml hydrocortisone 269 mg / ml, 200 ml ITES của 500X, 200 ml O-phosphorylethanolamine 0,05 M, 200 ml adenine 90 mM, 200 ml Progesterone của 2 nM, 240
ml CaCl2 của 1 M, 200 ml Triiodothyronine 10 nM và 100 ml sơ sinh trong huyết thanh bê. Để làm vừa III (300ml), trộn các thuốc thử sau: 142,5 ml DMEM, 142,5 ml F12 (HAM) thì 6 ml L-glutamine 200 mM, 600 ml hydrocortisone 269 mg / ml, 600 ml ITES của 500X , 600 ml O-phosphorylethanolamine 0,05 M, 600 adenine ml 90 mM, 600 ml Progesterone của 2 nM, 720 ml CaCl2 của 1 M, 600 ml Triiodothyronine 10 nM và 6 mL huyết thanh bê sơ sinh.

6. Trypsinize tế bào sừng của con người từ bình nuôi cấy với 0,05% trypsin / EDTA, trung hòa trypsin với chất ức chế đậu nành đậu trypsin (250 mg / L trong 1x phosphate mặn đệm), quay xuống, resuspend một viên di động tại 4,17 tế bào x106 / mL trong da tái tạo lại tôi vừa .
7. Trypsinize melanocytes con người hoặc các tế bào khối u ác tính từ bình nuôi cấy với 0,05% trypsin / EDTA, hóa giải trypsin với đậu nành chất ức chế trypsin, quay xuống, resuspend một viên di động tại 0,83 tế bào x106 / mL trong da tái tạo I. trung bình
8. Di vừa rửa từ cả bên trong và bên ngoài của mỗi chèn.
9. Thêm tái tạo lại da trung bình I (1,5 ml vào bên trong và 10 mL ra bên ngoài của mỗi chèn).
10. Lấy 600 ml dịch treo tế bào của tế bào sừng và 600 treo tế bào melanocytes ml hoặc các tế bào hắc tố, trộn đều. Bôi 200 ml hỗn hợp thả treo tế bào bằng cách thả vào bên trong của mỗi chèn. Đối với da tái tạo lại tế bào gốc, sử dụng 100 ml chỉ treo keratinocyte. Ủ trong 2 ngày 37 ° C.
11. Hút da tái tạo lại môi tôi từ cả bên trong và bên ngoài của mỗi chèn. Thêm da tái tạo lại môi trường II (2 mL vào bên trong và 10 ml với bên ngoài). Ủ thêm 2 ngày ở 37 ° C.
12. Da Hút tái tạo lại môi trường II từ bên trong và bên ngoài của mỗi chèn, thêm 7,5 ml da tái tạo lại vừa III chỉ bên ngoài. Từ thời điểm này, bề mặt của tái cấu trúc bắt đầu được tiếp xúc với