IntroductionEnzyme stability, which

Introduction
Enzyme stability, which includes thermostability, oxidative stability and resistance to undesired aggregation and precipitation, is critical in industrial applications of biocatalysts, and in biotechnology all of these factors contribute to the “robustness” of a protein. Numerous approaches have been reported to improve thermal and oxidative stability using site-specific mutagenesis guided by rational design, yet further progress is hindered by the lack of understanding of the factors involved.1–3 For instance, intermolecular interactions can lead to significant aggregation and subsequent precipitation, a phenomenon which is difficult to predict. Directed evolution4–9 offers an alternative method for improving the robustness of proteins in biotechnology,10 with error-prone polymerase chain reaction (epPCR) and/or DNA shuffling being the most popular gene mutagenesis techniques in this endeavor. In many cases this approach is superior to rational design, although at the expense of having to screen large mutant libraries, which is still considered to be the bottleneck of directed evolution in general.11 The need for thermostable proteins is so important that thermostabilization studies continue to be reported.12–17

Recently, we proposed a different method to evolve enzyme thermostability18, 19 by iterative saturation mutagenesis (ISM) applied at specific amino acid positions in an enzyme. To guide the decision-making regarding the amino acid sites to be altered, the B-FIT method was developed, in which residues with high B-factors in the crystal structure of the target enzyme are considered appropriate mutation candidates. The rationale behind this approach is the higher rigidity of thermostable proteins compared to their mesophilic counterparts at ambient temperatures,3 and the belief that targeted mutagenesis at flexible regions as indicated by high B-factors could lead to rigidification and thus thermostabilization.

We applied the B-FIT approach to Bacillus subtilis Lipase A (LipA).18, 19 LipA is a mesophilic protein, which has been well characterized.20, 21 Its three-dimensional structure was determined using crystals obtained at either basic conditions22, 23 or at acidic pH.24 In the past, the Rao group described the use of directed evolution based on epPCR to enhance the thermostability of LipA significantly.25–27 As a result of several rounds of ISM at sites displaying the highest B-factors in one of the X-ray structures,23 we obtained mutants that retained significant activity after treatment at temperatures above 65°C, whereas the wild-type (WT) lipase lost all activity. In this study, we report biophysical investigations for the three best B-FIT-evolved LipA mutants along with WT enzyme, thereby shedding light on the origin of their enhanced activity retention upon thermal treatment. We characterized these mutants using thermal inactivation profiles, melting experiments monitored by circular dichroism (CD) and structural characterization by X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance (NMR). We show that the point mutations introduced during the evolutionary process significantly reduce the undesired precipitation tendency of LipA unfolding intermediates upon heating. This reduction of precipitation enhances the proficiency of an enzyme as a catalyst in biotechnology, an aspect of protein engineering that has not received much attention thus far.

Go to:
Results and Discussion
Thermal inactivation profiles

Thermal inactivation profiles describe the residual activity retained after heating a protein sample and subsequent cooling. Previously, using the B-FIT approach, LipA variants were found with significant activity retention (measured using p-nitrophenyl caprylate as a substrate) after heating over 65°C and cooling down to room temperature. Three of these variants are studied here in detail, namely: variant IX (K112D, M134D, Y139C, I157M) obtained in the 4th ISM step and used as parent for the last round of saturation mutagenesis, variant X (R33Q, D34N, K35D, K112D, M134D, Y139C, I157M) obtained in the last round of ISM, and variant XI (R33G, K112D, M134D, Y139C, I157M) also identified in the final ISM round.18, 19

Thermal inactivation experiments at neutral pH [Fig. 1(A)] reflect the selection conditions applied during the directed evolution process.18, 19 As anticipated, WT protein retained almost no activity after heating and cooling, whereas the highest residual activity was found for variants X and XI, and slightly lower activity for variant IX. This high activity retention might originate from either improved thermodynamic stability, or from improved kinetic stability. Kinetic stability might be caused by, for example, more favorable refolding properties, reduced irreversible aggregation and/or precipitation of the mutants.

Figure 1
Figure 1
Thermal inactivation profiles of Lipase A variants determined at various conditions (panels A–C). Wild-type enzyme is represented by black lines, variant IX by blue lines, variant X by green lines and variant XI by red lines. Panel D shows the ...
WT LipA does not retain its activity upon thermal treatment even at low concentrations (1 μM) at neutral pH. However, when protein aggregation is limited, for example, at low pH28 [Fig. 1(B)] or in the presence of guanidinium hydrochloride29 [Fig. 1(C)], all LipA variants along with WT retained high activity levels comparable to the untreated protein even after application of high temperature. Therefore it can be concluded that in the absence of protein aggregation the refolding properties of WT and variants are similar.

Larger activity loss was observed at higher concentrations of the enzyme [Fig. 1(D)], again suggesting a role of protein precipitation in the activity recovery of LipA evolved mutants. Importantly, precipitation obscures results obtained using techniques that require high protein concentrations (e.g., CD or NMR).

Interestingly, the activity retention of the evolved variants is larger from species present at 80°C than from intermediates present at 60°C. Additional experiments in which the enzyme was kept at these temperatures for different time periods support this observation (Supporting Information Fig. S3). Since at pH 10 reconstitution from the 60°C intermediates becomes as efficient as from the 80°C intermediates (Supporting Information Fig. S2A), the retention of functional mutants from 60°C intermediates is affected by electrostatic interactions.

In the B-FIT study of LipA only surface residues were addressed and the majority of the mutations involved charged residues (two of four mutations in variant IX, five of seven in variant XI and three of five in variant XI). Additional thermal inactivation profiles determined using various buffer compositions (Supporting Information Fig. S2) indicated a role of the ionic interactions. Therefore, an altered surface charge distribution might be responsible for the enhanced activity retention upon thermal treatment of the evolved mutants.

In general, folding properties of the variants are similar to those of WT lipase, which is suggested by thermal inactivation profiles recorded when aggregation is reduced. This conclusion is further supported by molecular dynamics simulations, where similar unfolding patterns of WT and variant X were found (Supporting Information Fig. S8). Therefore, we concluded that folding pattern is unlikely to be responsible for the differences in activity retention upon thermal treatment of LipA WT and mutants. This leaves an increase of the thermodynamic stability of the fold, reduction of irreversible aggregation propensity of the unfolding intermediates and insolubility as possible explanations of the efficient reconstitution of the evolved mutants upon thermal treatment.

Characterization of recovered of LipA variant XI by NMR spectroscopy

An important point concerns the question whether the enzyme recovers its tertiary structure after the thermal inactivation experiment. It was tested using NMR spectra recorded for native and thermally treated15N-labeled variant XI LipA.

Heating and cooling down of diluted LipA variant XI solution produced a decent amount of protein for the NMR experiments. However, when WT enzyme was subjected to a similar procedure, no significant amount of soluble protein was obtained due to protein precipitation even from the diluted solution.

After heating and cooling variant XI shows a conformation very similar to the untreated protein, as peaks in 1D 1H and 2D [15N,1H]-HSQC spectra (Fig. 2) do not change their positions dramatically after thermal treatment. Despite the high similarity of the HSQC spectra, there are certain subtle differences between native LipA variant XI and protein treated at high temperature (see Supporting Information Fig. S1).

Kết quả (Việt) 1:

Giới thiệuỔn định enzym, bao gồm thermostability, sự ổn định oxy hóa và sức đề kháng để nhiễu tập hợp và mưa, là rất quan trọng trong các ứng dụng công nghiệp của biocatalysts, và công nghệ sinh học tất cả những yếu tố góp phần vào mạnh mẽ"" của một protein. Nhiều phương pháp tiếp cận đã được báo cáo để cải thiện nhiệt và sự ổn định oxy hóa bằng cách sử dụng trang mutagenesis hướng dẫn bởi thiết kế hợp lý, nhưng vẫn tiếp tục tiến bộ là cản trở bởi việc thiếu của sự hiểu biết về yếu tố involved.1–3 ví dụ, intermolecular tương tác có thể dẫn đến quan trọng tập hợp và lượng mưa tiếp theo, một hiện tượng mà là khó dự đoán. Đạo diễn evolution4-9 cung cấp một phương pháp thay thế cho việc cải thiện mạnh mẽ của các protein trong công nghệ sinh học, 10 với phản ứng chuỗi trùng hợp dễ bị lỗi (epPCR) và/hoặc DNA shuffling là phổ biến nhất gen mutagenesis kỹ thuật trong nỗ lực này. Trong nhiều trường hợp cách tiếp cận này là vượt trội so với thiết kế hợp lý, mặc dù chi phí phải màn hình thư viện lớn của đột biến, mà vẫn được coi là để là các nút cổ chai của đạo diễn sự tiến hóa trong sự cần thiết cho các protein là rất quan trọng thermostabilization nghiên cứu tiếp tục là reported.12–17 general.11Gần đây, chúng tôi đề xuất một phương pháp khác nhau để phát triển các enzym thermostability18, 19 bởi bão hòa lặp đi lặp lại mutagenesis (ISM) được áp dụng tại các vị trí cụ thể acid amin trong một loại enzyme. Để hướng dẫn quyết định liên quan đến các trang web axit amin để được thay đổi, phương pháp B-phù hợp được phát triển, trong đó các dư lượng với cao B-yếu tố trong cấu trúc tinh thể của enzym mục tiêu được coi là ứng cử viên thích hợp đột biến. Lý do đằng sau cách tiếp cận này là rigidity cao của các protein so với đối tác của họ hay ở nhiệt độ môi trường xung quanh, 3 và niềm tin rằng nhắm mục tiêu mutagenesis tại khu vực linh hoạt như được chỉ ra bởi cao B-yếu tố có thể dẫn đến rigidification và do đó thermostabilization.Chúng tôi áp dụng các phương pháp B-FIT để Bacillus subtilis Lipase A (LipA).18, 19 LipA là một loại protein hay, đã là cũng characterized.20, 21 cấu trúc 3 chiều của nó đã được xác định bằng cách sử dụng tinh thể lấy tại một trong hai cơ bản conditions22, 23 hoặc có tính axit pH.24 trong quá khứ, nhóm Rao mô tả việc sử dụng của đạo diễn sự tiến hóa dựa trên epPCR để tăng cường thermostability LipA significantly.25–27 là kết quả của nhiều vòng ISM tại các trang web hiển thị cao nhất yếu tố B trong một cấu trúc x-quang, 23 chúng tôi được người đột biến giữ lại hoạt động đáng kể sau khi điều trị ở nhiệt độ trên 65° C, trong khi các loại hoang (WT) lipase mất tất cả hoạt động. Trong nghiên cứu này, chúng tôi báo cáo điều tra lý sinh cho các ba tốt nhất B-phù hợp với phát triển LipA người đột biến cùng với WT enzym, do đó đổ ánh sáng về nguồn gốc của họ duy trì tăng cường hoạt động sau khi điều trị nhiệt. Chúng tôi đặc trưng các đột biến bằng cách sử dụng cấu hình ngừng hoạt động nhiệt, nóng chảy thí nghiệm theo dõi bởi tròn dichroism (CD) và các đặc tính cấu trúc tinh thể học tia x và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Chúng tôi hiển thị đột biến điểm giới thiệu trong quá trình tiến hóa một cách đáng kể làm giảm xu hướng không mong muốn mưa của LipA unfolding trung gian khi hệ thống sưởi. Sự sụt giảm này mưa tăng cường năng lực của một loại enzyme như một chất xúc tác trong công nghệ sinh học, một khía cạnh của protein kỹ thuật mà đã không nhận được nhiều sự chú ý vậy, đến nay.Đi tới:Kết quả và thảo luậnCấu hình ngừng hoạt động nhiệtNgừng hoạt động nhiệt cấu hình mô tả các hoạt động dư giữ lại sau khi sưởi ấm một protein mẫu và sau đó làm mát. Trước đây, sử dụng phương pháp tiếp cận phù hợp B, LipA biến thể đã được tìm thấy với hoạt động đáng kể (đo bằng cách sử dụng p-nitrophenyl caprylate như bề mặt một) sau khi sưởi ấm hơn 65° C và làm mát nhiệt độ phòng. Ba trong số các biến thể được nghiên cứu ở đây chi tiết, cụ thể là: biến thể IX (K112D, M134D, Y139C, I157M) thu được trong ISM bước 4 và được sử dụng như là các phụ huynh cho vòng cuối cùng của bão hòa mutagenesis, phiên bản X (R33Q, D34N, K35D, K112D, M134D, Y139C, I157M) thu được trong vòng cuối cùng của ISM, và biến thể XI (R33G, K112D, M134D, Y139C, I157M) cũng được xác định trong round.18 ISM cuối cùng, 19Ngừng hoạt động nhiệt thí nghiệm ở pH trung tính [hình 1(A)] phản ánh các lựa chọn điều kiện áp dụng trong process.18 đạo diễn tiến hóa, 19 như dự đoán, WT protein giữ lại hầu như không có hoạt động sau khi sưởi ấm và làm mát, trong khi các hoạt động dư cao nhất được tìm thấy cho phiên bản X, XI và các hoạt động nhẹ thấp hơn cho phiên bản IX. Duy trì cao hoạt động này có thể có nguồn gốc từ một trong hai sự ổn định nhiệt được cải thiện, hoặc từ sự ổn định động lực cải tiến. Động lực ổn định có thể được gây ra bởi, cho ví dụ, thuận lợi hơn refolding thuộc tính, giảm không thể thay đổi tập hợp và/hoặc mưa của những người đột biến.Hình 1Hình 1Ngừng hoạt động nhiệt hồ sơ của Lipase một biến thể xác định các điều kiện khác nhau (bảng A-C). Hoang dã-loại enzyme được đại diện bởi dòng đen, biến thể IX của dòng màu xanh, phiên bản X dòng màu xanh lá cây và biến thể XI bởi đường màu đỏ. Bảng D cho thấy các...WT LipA không giữ lại hoạt động của nó sau khi điều trị nhiệt thậm chí ở nồng độ thấp (1 μM) ở pH trung tính. Tuy nhiên, khi tập hợp protein là hạn chế, ví dụ, ở thấp pH28 [hình 1(B)] hay sự hiện diện của guanidinium hydrochloride29 [hình 1(C)], tất cả các phiên bản LipA cùng với WT giữ lại mức độ hoạt động cao so sánh với các protein không được điều trị ngay cả sau khi các ứng dụng của nhiệt độ cao. Do đó, nó có thể được kết luận rằng trong sự vắng mặt của protein tập hợp các thuộc tính refolding của WT và biến thể là tương tự.Lớn hơn hoạt động mất được quan sát thấy ở các nồng độ cao của enzym [hình 1(D)], một lần nữa cho thấy một vai trò của protein mưa trong phục hồi hoạt động của LipA phát triển đột biến. Quan trọng, mưa che lấp kết quả thu được bằng cách sử dụng kỹ thuật đòi hỏi nồng độ protein cao (ví dụ như, CD hoặc NMR).Điều thú vị, duy trì hoạt động của các phiên bản phát triển là lớn hơn từ loài hiện diện ở 80° C hơn từ trung gian hiện tại ở 60° C. Thí nghiệm bổ sung trong đó enzym đã được giữ ở các nhiệt độ trong thời gian thời gian khác nhau hỗ trợ quan sát này (hỗ trợ thông tin hình. S3). Kể từ khi lúc pH 10 reconstitution từ 60° C trung gian trở nên hiệu quả kể từ trung gian 80 ° C (hỗ trợ thông tin hình. S2A), lưu giữ chức năng đột biến từ 60 ° C trung gian bị ảnh hưởng bởi tĩnh điện tương tác.Trong nghiên cứu B-FIT của LipA dư lượng bề mặt chỉ được giải quyết và phần lớn các đột biến tham gia tính dư lượng (hai trong số bốn đột biến trong phiên bản IX, năm trong số bảy trong biến thể XI và ba năm trong biến thể XI). Ngừng hoạt động nhiệt bổ sung hồ sơ xác định bằng cách sử dụng các bộ đệm bố cục trang trí (hỗ trợ thông tin hình. S2) chỉ ra một vai trò của sự tương tác ion. Vì vậy, một phân phối thay đổi bề mặt phí có thể chịu trách nhiệm cho việc lưu giữ các hoạt động nâng cao sau khi điều trị nhiệt phát triển đột biến.Nói chung, gấp thuộc tính của các biến thể là tương tự như của WT lipase, đó đề nghị của hồ sơ nhiệt ngừng hoạt động ghi lại khi tập hợp là giảm. Kết luận này được hỗ trợ thêm bởi mô phỏng động lực học phân tử, nơi tương tự như mẫu unfolding của WT và phiên bản X được tìm thấy (hỗ trợ thông tin hình. 1⁄2S8). Do đó, chúng tôi kết luận rằng gấp mô hình là dường như không chịu trách nhiệm về sự khác biệt trong hoạt động lưu giữ khi điều trị nhiệt LipA WT và người đột biến. Điều này lá tăng sự ổn định nhiệt của màn hình đầu tiên, giảm số các tập hợp không thể đảo ngược xu hướng trung gian và insolubility như là có thể giải thích về reconstitution hiệu quả của đột biến phát triển sau khi điều trị nhiệt unfolding.Các đặc tính của thu hồi của LipA biến thể XI bởi phổ NMRMột điểm quan trọng liên quan đến câu hỏi cho dù enzym phục hồi cấu trúc bậc của nó sau khi thử nghiệm nhiệt ngừng hoạt động. Nó đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng quang phổ NMR thu âm cho phiên bản gốc và nhiệt treated15N, dán nhãn XI LipA.Sưởi ấm và làm mát của pha loãng LipA biến thể XI giải pháp sản xuất một số tiền phong nha của protein cho thử nghiệm NMR. Tuy nhiên, khi WT enzym đã phải chịu một thủ tục tương tự, không có số lượng đáng kể của protein hòa tan được thu được do protein mưa ngay cả từ các giải pháp pha loãng.Sau khi hệ thống sưởi và làm mát biến thể XI cho thấy một cấu rất tương tự như các protein không được điều trị, như đỉnh trong 1D 1H và 2D [15N, 1H]-HSQC quang phổ (hình 2) không thay đổi vị trí của họ đáng kể sau khi điều trị nhiệt. Mặc dù sự giống nhau cao của quang phổ HSQC, có là một số sự khác biệt tinh tế giữa bản xứ LipA biến thể XI và protein được điều trị ở nhiệt độ cao (xem hỗ trợ thông tin hình. S1).

Kết quả (Việt) 2:

Giới thiệu
Enzyme ổn định, trong đó bao gồm chịu nhiệt, độ ổn định oxy hóa và kháng để tập hợp không mong muốn và mưa, là rất quan trọng trong các ứng dụng công nghiệp của biocatalysts, và công nghệ sinh học trong tất cả các yếu tố góp phần vào sự "vững mạnh" của một protein. Nhiều phương pháp đã được báo cáo để cải thiện sự ổn định nhiệt và oxy hóa bằng cách sử dụng đột biến trang web cụ thể hướng dẫn bởi thiết kế hợp lý, chưa tiến bộ hơn nữa bị cản trở bởi sự thiếu hiểu biết về các yếu tố involved.1-3 Ví dụ, sự tương tác giữa các phân tử có thể dẫn đến sự kết hợp đáng kể và lượng mưa tiếp theo, một hiện tượng rất khó dự đoán. Đạo evolution4-9 cung cấp một phương pháp khác để cải thiện sự vững mạnh của protein trong công nghệ sinh học, 10 với phản ứng dễ bị lỗi chuỗi polymerase (epPCR) và / hoặc xáo trộn DNA bị đột biến gen là kỹ thuật phổ biến nhất trong nỗ lực này. Trong nhiều trường hợp, cách tiếp cận này là vượt trội so với thiết kế hợp lý, mặc dù tại các chi phí của việc sàng lọc các thư viện đột biến lớn, mà vẫn được coi là nút cổ chai của sự tiến hóa đạo trong general.11 Nhu cầu protein chịu nhiệt là rất quan trọng mà các nghiên cứu tiếp thermostabilization để được reported.12-17 Gần đây, chúng tôi đề xuất một phương pháp khác nhau tiến hóa enzyme thermostability18, 19 bởi lặp đi lặp lại đột biến bão hòa (ISM) áp dụng tại các vị trí axit amin đặc biệt trong một enzyme. Để hướng dẫn các quyết định liên quan đến các trang web axit amin được thay đổi, phương pháp B-FIT đã được phát triển, trong đó dư lượng với B-yếu tố cao trong cấu trúc tinh thể của các enzyme tiêu được coi là ứng cử viên thích hợp đột biến. Lý do đằng sau phương pháp này là độ cứng cao hơn các protein chịu nhiệt so với các đối tác của họ ở nhiệt độ mesophilic môi trường xung quanh, 3 và niềm tin rằng mục tiêu đột biến tại vùng linh hoạt như được chỉ ra bởi các yếu tố B-cao có thể dẫn đến rigidification và do đó thermostabilization. Chúng tôi áp dụng các B Cách tiếp cận -FIT để Bacillus subtilis Lipase A (lipa) .18, 19 Lipa là một protein mesophilic, mà đã nổi characterized.20, 21 cấu trúc ba chiều của nó được xác định bằng cách sử dụng các tinh thể thu được ở hai conditions22 cơ bản, 23 hoặc tại pH có tính axit .24 Trong quá khứ, các nhóm Rao mô tả việc sử dụng các quá trình tiến hóa của đạo dựa trên epPCR để tăng cường chịu nhiệt của Lipa significantly.25-27 Như một kết quả của nhiều vòng ISM tại trang web hiển thị B-yếu tố cao nhất tại một trong những X cấu trúc ray, 23 chúng tôi thu được đột biến mà giữ lại hoạt động đáng kể sau khi điều trị ở nhiệt độ trên 65 ° C, trong khi các loại hoang dã (WT) lipase bị mất tất cả các hoạt động. Trong nghiên cứu này, chúng tôi báo cáo điều tra về sinh lý cho tốt nhất ba Lipa đột biến B-FIT-tiến hóa cùng với enzyme WT, qua đó làm sáng tỏ nguồn gốc của lưu giữ các hoạt động tăng cường của họ khi xử lý nhiệt. Chúng tôi đặc trưng những đột biến bất hoạt nhiệt sử dụng hồ sơ, làm tan chảy các thí nghiệm theo dõi bởi lưỡng sắc tròn (CD) và đặc tính cấu trúc của tinh thể học X-quang và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Chúng tôi thấy rằng các đột biến điểm giới thiệu trong suốt quá trình tiến hóa làm giảm đáng kể lượng mưa có xu hướng không mong muốn của Lipa mở ra trung gian khi sưởi ấm. Mức giảm này có lượng mưa tăng cường trình độ của một loại enzyme như một chất xúc tác trong công nghệ sinh học, một khía cạnh của kỹ thuật protein mà đã không nhận được nhiều sự chú ý cho đến nay. Tới: Kết quả và thảo luận profile bất hoạt nhiệt profile bất hoạt nhiệt mô tả các hoạt động còn lại được giữ lại sau khi nung nóng mẫu protein và làm lạnh tiếp theo. Trước đó, sử dụng phương pháp B-FIT, biến thể Lipa được tìm thấy với duy trì hoạt động có ý nghĩa (đo bằng p-nitrophenyl caprylate như một chất nền) khi đun nóng trên 65 ° C và làm lạnh xuống nhiệt độ phòng. Ba trong số các biến thể này được nghiên cứu ở đây một cách chi tiết, cụ thể là: biến IX (K112D, M134D, Y139C, I157M) thu được ở bước 4 ISM và sử dụng như phụ huynh cho các vòng đấu cuối cùng của bão hòa đột biến, biến thể X (R33Q, D34N, K35D, K112D, M134D, Y139C, I157M) thu được trong các vòng đấu cuối cùng của ISM, và biến thể XI (R33G, K112D, M134D, Y139C, I157M) cũng được xác định trong ISM round.18 thức, 19 thí nghiệm bất hoạt nhiệt ở pH trung tính [Hình. 1 (A)] phản ánh các điều kiện lựa chọn áp dụng trong quá trình tiến hóa process.18 đạo, 19 Như dự đoán, protein WT giữ lại gần như không có hoạt động sau khi sưởi ấm và làm mát, trong khi các hoạt động còn lại cao nhất được tìm thấy cho các biến thể X và XI, và hoạt động thấp hơn một chút cho biến IX. Duy trì hoạt động cao này có thể bắt nguồn từ một trong hai cải thiện sự ổn định nhiệt động lực học, hoặc từ việc cải thiện sự ổn định động học. Ổn định động học có thể được gây ra bằng cách, ví dụ, tính refolding thuận lợi hơn, giảm tập thể đảo ngược và / hoặc kết tủa của các đột biến. Hình 1 Hình 1 profile bất hoạt nhiệt của Lipase Một biến thể xác định ở các điều kiện khác nhau (bảng A-C). Wild-loại enzyme được biểu diễn bởi đường màu đen, biến IX bởi đường màu xanh, biến thể X bởi các đường màu xanh lá cây và biến XI của dòng màu đỏ. Bảng D cho thấy ... WT Lipa không giữ lại hoạt động của mình khi xử lý nhiệt thậm chí ở nồng độ thấp (1 mM) ở pH trung tính. Tuy nhiên, khi kết hợp protein được giới hạn, ví dụ, tại pH28 thấp [Fig. 1 (B)] hoặc trong sự hiện diện của guanidinium hydrochloride29 [Fig. 1 (C)], tất cả các biến thể Lipa cùng với WT giữ lại mức độ hoạt động cao so sánh với các protein không được điều trị ngay cả sau khi ứng dụng của nhiệt độ cao. Vì vậy có thể kết luận rằng trong trường hợp không có hợp protein đặc tính refolding của WT và các biến thể tương tự. lỗ hoạt động lớn hơn đã được quan sát thấy ở nồng độ cao của các enzyme [Fig. 1 (D)], một lần nữa cho thấy vai trò của kết tủa protein trong phục hồi hoạt động của Lipa phát triển đột biến. Quan trọng hơn, lượng mưa che khuất các kết quả thu được bằng cách sử dụng các kỹ thuật đòi hỏi nồng độ protein cao (ví dụ, CD hoặc NMR). Điều thú vị là, việc lưu giữ các hoạt động của những biến thể phát triển lớn hơn từ các loài có mặt tại 80 ° C so với từ trung gian có mặt tại 60 ° C. Thí nghiệm bổ sung trong đó enzyme được giữ ở nhiệt độ này cho khoảng thời gian khác nhau hỗ trợ quan sát này (Hỗ trợ thông tin hình. S3). Kể từ khi ở pH 10 pha từ 60 ° C trở thành trung gian như là hiệu quả từ 80 ° C trung gian (thông tin hỗ trợ hình. S2A), việc lưu giữ các đột biến chức năng từ 60 ° C trung gian bị ảnh hưởng bởi các tương tác tĩnh điện. Trong B-FIT Nghiên cứu của Lipa chỉ dư lượng bề mặt đã được giải quyết và phần lớn các đột biến liên quan đến dư lượng tính (hai trong số bốn đột biến trong phiên IX, năm trong số bảy trong biến XI và ba trong số năm trong phiên XI). Thêm profile bất hoạt nhiệt được xác định bằng cách sử dụng tác phẩm đệm khác nhau (Hỗ trợ thông tin hình. S2) chỉ ra vai trò của sự tương tác ion. Vì vậy, một mặt phân bố điện bị thay đổi có thể chịu trách nhiệm cho việc lưu giữ các hoạt động tăng cường khi xử lý nhiệt của các đột biến phát triển. Nói chung, tài sản gấp của các biến thể tương tự như của WT lipase, được đề xuất bởi profile bất hoạt nhiệt ghi nhận khi kết hợp là giảm. Kết luận này được hỗ trợ thêm bởi động mô phỏng phân tử, nơi diễn ra các mô hình tương tự của WT và biến thể X đã được tìm thấy (Hỗ trợ thông tin hình. S8). Do đó, chúng tôi kết luận rằng mẫu gấp là không chịu trách nhiệm về sự khác biệt trong hoạt động duy trì khi điều trị nhiệt của Lipa WT và đột biến. Điều này làm tăng sự ổn định nhiệt của nếp gấp, giảm tập thể đảo ngược xu hướng của các chất trung gian diễn ra và không tan như có thể giải thích về sự tái tạo hiệu quả của các đột biến phát triển khi điều trị nhiệt. Đặc tính của phục hồi của Lipa biến XI của NMR quang phổ Một quan trọng điểm liên quan đến câu hỏi liệu các enzyme phục hồi cấu trúc đại học của mình sau khi thí nghiệm bất hoạt nhiệt. Nó đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng NMR được ghi lại cho mẹ đẻ và nhiệt treated15N-nhãn biến XI Lipa. thống sưởi ấm và làm mát xuống các pha loãng giải pháp Lipa biến XI sản xuất một số tiền khá protein cho các thí nghiệm NMR. Tuy nhiên, khi enzyme WT được đưa vào quá trình tương tự, không có số lượng đáng kể của protein hòa tan thu được do kết tủa protein và thậm chí từ các dung dịch pha loãng. Sau khi làm nóng và làm mát biến XI cho thấy một dáng rất giống với các protein không được điều trị, như đỉnh núi trong 1D 1H và 2D [15N, 1H] phổ -HSQC (Fig. 2) không thay đổi vị trí của họ đáng kể sau khi xử lý nhiệt. Mặc dù có sự tương đồng cao của HSQC quang phổ, có sự khác biệt tinh tế nhất định giữa bản địa Lipa biến XI và protein điều trị ở nhiệt độ cao (xem Hỗ trợ thông tin hình. S1).