Cannell et al. 1977). The numerous

Cannell et al. 1977). The numerous hybrids that apparently

have resulted are still generally referred to as Assam, Cam-
bod or China types depending on their morphological prox-

The success of any breeding or genetic conservation

programme is dependent on an understanding of the

amount and distribution of the genetic variation present in

the genepool. Traditionally, a combination of morpholog-
ical and agronomic traits has been used to measure genetic

diversity. However, tea is a heterogenous plant with many

overlapping morphological, biochemical and physiologi-
cal attributes (Purseglove 1968; Wickremasinghe 1979;

Banerjee 1988b). In addition, since most of the vegetative

characteristics are influenced by environmental factors and

show a continuous variation and a high degree of plastic-
ity, it has proved difficult to identify discrete taxonomic

groups (Wickramaratne 1981). Furthermore, those which

have been identified may not reflect true genetic similar-
ities. In an attempt to overcome these problems biochem-
ical and molecular techniques have been used to monitor

genetic variability (Wachira et al. 1994). Isozymes have

been used extensively to characterise plant genetic re-
sources (Jana and Pietzrak 1988; Chengyin et al. 1992; Je-
linski and Cheliak 1992), but they are limited by the rela-
tively low levels of polymorphism detectable. Restriction

fragment length polymorphisms (RFLPs) overcome this

problem and have been used to investigate genetic diver-
sity in cultivated plants and their wild relatives (Tanksley

et al. 1989; Miller and Tanksley 1990; Wang et al. 1992).

However, the RFLP assay requires large quantities of rel-
atively pure DNA, and the frequent use of radioisotopes in

the detection method makes it technically demanding, la-
borious and costly to characterise large numbers of sam-
ples. The polymerase chain reaction (PCR)-based ran-
domly amplified polymorphic DNA (RAPD) assay (Wil-
liams et al. 1990; Welsh and McClelland 1990; Hu and Qui-
ros 1992; Wilde et al. 1992; Chalmers et al. 1992; Russell

et al. 1993; Dawson et al. 1995; Wachira et al. 1995) over-
came many of the technical limitations of RFLPs but has

proved sensitive to experimental conditions and as a result

questions have been raised about their reproducibility.

Recently a novel PCR-based assay for plant DNA finger-
printing, amplified fragment length polymorphism

(AFLPs), has been developed which reveals significant

levels of DNA polymorphism (Vos et al. 1995). Initial

reports (Meksem et al. 1995; Becker et al. 1995) indicate

that AFLP is a reliable and robust genetic molecular

marker assay. The number of polymorphisms detected per

reaction is much higher than revealed by RFLPs or RAPDs

because of the number of loci sampled in a single assay.

AFLPs offer an opportunity to perform detailed genetic

studies in a large number of organisms and species. In the

Adaptor ligation

Accession Type Source of material Variety

1. Dhoedham Seedjat Dhoedham Tea Estate, Assam, India Assam

2. T-253 Variety (selection) Tea Research Association, Nagrakata Substation, China

3. TV9 Variety (selection) Tocklai Experimental Station, Jorhat, Asam, India Assam

4. Sundaram Variety UPASI Research Station, Nirardam PO Valparai, Assam

5. P-312 Variety (selection) Tea Research Association, Nagrakata Substation, China

6. Samsingh Seedjat Sam Sing Tea Estate, Mettallai PO Dooras, West Bengal, China

7. Kangra Asha (KVK-1) Variety (selection) Tea Experiment Station, Palampur, Kangra, India China

8. Kangra Jwala (KVK-3) Variety (selection) Tea Experiment Station, Palampur, Kangra, India Assam

9. M-6 Selection Mansimble Tea Estate, Palampur, Kangra, India China

10. M-18 Selection Mansimble Tea Estate, Palampur, Kangra, India China

11. M-51 Selection Mansimble Tea Estate, Palampur, Kangra, India China

12. M-93 Selection Mansimble Tea Estate, Palampur, Kangra, India China

13. C-33 Selection Chambi Tea Estate, Palampur, Kangra, India China

14. C-37 Selection Chambi Tea Estate, Palampur, Kangra, India China

15. C-124 Selection Chambi Tea Estate, Palampur, Kangra, India China

16. 382/1 Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya Assam

17. D99/10 Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya Assam

18. 301/2 Variety (introduction from Reunion) TRFK, Kericho, Kenya Cambod

19. 301/3 Variety (introduction from Reunion) TRFK, Kericho, Kenya Cambod

20. 6/8 Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya Assam

21. 7/9 Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya China

22. 56/89 Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya China

23. 4/28 Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya China

24. 14/1 Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya China

25. K/Purple Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya China

26. SFS 150 Variety (introduction from Malawi) TRFK, Kericho, Kenya Assam

27. 430/43 Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya Assam

28. BB7 Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya Assam

29. BB21 Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya Assam

30. BB35 Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya Assam

31. TN 14/3 Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya China

32. 471/15 Variety (selection) TRFK, Kericho, Kenya Assam

West Bengal, India

Coimbatore, India

West Bengal, India

India

MseI+3 primers M32: 5′-GATGAGTCCTGAGTAAAAC-3′

M39: 5′-GATGAGTCCTGAGTAAAGA-3′

M47: 5′-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3′

M55: 5′-GATGAGTCCTGAGTAACGA-3′

EO1, 75 ng primer MO1, 1 U Taq DNA polymerase (Perkin Elmer,

USA), 2.5 μl of 10× PCR buffer (Perkin Elmer, USA) and 0.2 mM

dNTPs, in a final volume of 24 μl. The PCR reaction was performed

in a Perkin Elmer-9600 thermal cycler (Perkin Elmer, USA) using

the following temperature profile: 30 cycles of 30 s at 94°C, 30 s

at 60°C, 60 s at 72°C. After pre-amplification 55 μl TO.1E buffer

(10 mM TRIS, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) was added to each sample and

where a smear (0.2 kb) was visible.

End labelling

Only EcoRI compatible primers were labelled. Sufficient primer was

prepared for 35 selective amplifications by combining 3.5 μl δ-[33P]

ATP (1.11×1014 Bq/mmol), 3.5 μl of 10×T4 buffer (250 mM TRIS-
HCl, pH 7.5, 100 mM MgCl2, 50 mM DTT, 5 mM spermidine),

4.7 μl E (plus three selective nucleotides) primer (50 ng/μl stock),

0.9 μl T4 kinase (10 units/ml) and 22.4 μl H2O (final volume 35 μl).

Samples were incubated at 37°C for 30 min then heated to 70°C for

Selective PCR amplifications

Selective restriction fragment amplification was performed with a

(Table 2). Each 20 μl PCR reaction consisted of 3 μl pre-amplified

DNA, 50 ng labelled EcoRI+3 primer, 50 ng unlabelled EcoRI+3

primer, 50 ng unlabelled MseI+3 primer, 2 mM dNTP, 0.1 μl Taq

DNA polymerase (10 units/μl) and 2 μl PCR buffer (Perkin Elmer,

USA). The following cycle profile ensured optimal primer selec-
tivity: 1 cycle of 30 s at 94°C, 30 s at 65°C, 60 s at 72°C followed

by 11 cycles of 0.7°C lower annealing temperature each cycle and

The PCR product was mixed with 20 μl formamide loading buffer

(98% formamide, 10 mM EDTA, 0.005% each of xylene cyanol FF

and bromophenol blue) and denatured by incubation for 5 min at

90°C. The 6% polyacrylamide gels were prepared by mixing 65 ml

6% Easigel (Scotlab) and 450 μl 10% ammonium persulphate, de-
gassing and adding 20 μl TEMED. The gels were poured at least 4 h

before use and pre-run at 80 W for 30 min. Samples of 5 μl were

loaded per track and gels were run for 1.45 h at 80 W, transferred to

3 MM chromatography paper and dried on a gel drier for 2 h at 80°C.

Bands were scored as present or absent on autorads. The degree of

polymorphism was quantified using Shannon’s index of phenotypic

where pi is the frequency of phenotype i (King and Schaal 1989). Ho

be the diversity calculated from the phenotypic frequencies p in all

the populations considered together. Then the proportion of diver-
sity present within populations, Hpop/Hsp, can be compared with that

Estimates of similarity between genotypes were based on the

probability that an amplified fragment from one accession will also

Kết quả (Việt) 1:

Cannell et al. 1977). Nhiều giống lai đó rõ ràng

có kết quả vẫn thường được gọi là Assam, Cam-
quản trị hoặc Trung Quốc loại tùy thuộc vào của hình thái học prox-

sự thành công của bất kỳ bảo tồn giống hoặc di truyền

chương trình là phụ thuộc vào sự hiểu biết về các

số lượng và phân phối của các biến thể di truyền hiện nay trong

genepool. Theo truyền thống, một sự kết hợp của morpholog-
ical và nông học đặc điểm đã sử dụng để đo di truyền

đa dạng. Tuy nhiên, trà là một nhà máy heterogenous với nhiều

chồng chéo hình thái học, hóa sinh và physiologi-
cal thuộc tính (Purseglove năm 1968; Wickremasinghe năm 1979;

Banerjee 1988b). Ngoài ra, kể từ khi hầu hết các thực vật

đặc điểm chịu ảnh hưởng của yếu tố môi trường và

Hiển thị một biến thể liên tục và một mức độ cao của nhựa-
Anh, nó đã chứng minh khó khăn để xác định rời rạc phân loại

nhóm (Wickramaratne 1981). Hơn nữa, những người mà

đã được xác định có thể không phản ánh đúng di truyền tương tự-
ities. Trong một nỗ lực để khắc phục các vấn đề biochem-
ical và phân tử kỹ thuật đã được sử dụng để giám sát

biến đổi di truyền (Wachira et al. 1994). Isozymes có

sử dụng rộng rãi để nêu thực vật di truyền tái-
nguồn (Jana và Pietzrak năm 1988; Chengyin et al. 1992; Je-
linski và Cheliak năm 1992), nhưng họ được giới hạn bởi rela-
cách mức thấp của đa hình phát hiện. Hạn chế

mảnh chiều dài polymorphisms (RFLPs) vượt qua điều này

vấn đề và đã được sử dụng để điều tra di truyền diver-
sity trong trồng cây và thân nhân hoang dã của họ (Tanksley

et al. 1989; Miller và Tanksley 1990; Wang et al. 1992).

Tuy nhiên, các khảo nghiệm RFLP đòi hỏi một lượng lớn của rel-
atively tinh khiết DNA, và thường xuyên sử dụng đồng vị phóng xạ trong

phương pháp phát hiện làm cho nó về mặt kỹ thuật đòi hỏi, la-
borious và tốn kém để nêu một số lượng lớn của sam-
ples. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)-dựa trên chạy-
domly khuếch đại bướu khảo nghiệm DNA (RAPD) (Wil-
liams et al. 1990; Tiếng Wales và McClelland 1990; Hu và Qui-
ros 1992; Wilde et al. 1992; Chalmers et al. 1992; Russell

et al. 1993; Dawson và ctv 1995; Wachira et al. 1995) hơn-
đến nhiều người trong số những hạn chế kỹ thuật của RFLPs nhưng có

chứng minh nhạy cảm để thử nghiệm điều kiện và kết quả là

câu hỏi đã được nâng lên về reproducibility của họ.

Mới một cuốn tiểu thuyết dựa trên PCR khảo nghiệm cho thực vật DNA ngón tay-
in ấn, khuếch đại đoạn chiều dài đa hình

(AFLPs), đã được phát triển mà tiết lộ đáng kể

cấp của đa hình DNA (Vos et al. năm 1995). Ban đầu

báo cáo (Meksem et al. 1995; Becker et al. 1995) cho thấy

GENET đó là một đáng tin cậy và mạnh mẽ di truyền phân tử

đánh dấu khảo nghiệm. Số lượng polymorphisms phát hiện một

phản ứng là cao hơn nhiều so với tiết lộ bởi RFLPs hoặc RAPDs

vì số lượng loci lấy mẫu trong một khảo nghiệm đơn.

AFLPs cung cấp một cơ hội để thực hiện chi tiết di truyền

nghiên cứu trong nhiều sinh vật và các loài. Trong các

Adaptor ligation

gia nhập loại nguồn của tài liệu nhiều

1. Dhoedham Seedjat Dhoedham trà bất động sản, Assam, Ấn Độ Assam

2. Trung Quốc trà Hiệp hội nghiên cứu, Nagrakata trạm biến áp, T-253 loạt (lựa chọn)

3. TV9 loạt (lựa chọn) Tocklai thử nghiệm Station, Jorhat, Asam, Ấn Độ Assam

4. Tùng lâm nhiều UPASI trạm nghiên cứu, Nirardam PO có, Assam

5. Trung Quốc trà Hiệp hội nghiên cứu, Nagrakata trạm biến áp, P-312 loạt (lựa chọn)

6. Samsingh Seedjat Sam hát Tea Estate, Mettallai PO Dooras, West Bengal, Trung Quốc

7. Kangra Asha (KVK-1) nhiều (lựa chọn) trà thử nghiệm Station, Palampur, Kangra, Ấn Độ Trung Quốc

8. Kangra Jwala (KVK-3) nhiều (lựa chọn) trà thử nghiệm Station, Palampur, Kangra, Ấn Độ Assam

9. M-6 lựa chọn Mansimble trà Estate, Palampur, Kangra, Ấn Độ Trung Quốc

10. Lựa chọn M-18 Mansimble trà Estate, Palampur, Kangra, Ấn Độ Trung Quốc

11. M-51 lựa chọn Mansimble trà Estate, Palampur, Kangra, Ấn Độ Trung Quốc

12. M-93 lựa chọn Mansimble trà Estate, Palampur, Kangra, Ấn Độ Trung Quốc

13. C-33 lựa chọn Chambi trà Estate, Palampur, Kangra, Ấn Độ Trung Quốc

14. Lựa chọn C-37 Chambi trà Estate, Palampur, Kangra, Ấn Độ Trung Quốc

15. C-124 lựa chọn Chambi trà Estate, Palampur, Kangra, Ấn Độ Trung Quốc

16. 382/1 loạt (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Assam

17. Loạt các tuyến đường D99/10 (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Assam

18. 301/2 loạt (giới thiệu từ Reunion) TRFK, Kericho, Kenya Cambod

19. 301/3 loạt (giới thiệu từ Reunion) TRFK, Kericho, Kenya Cambod

20. 6/8 loại (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Assam

21. 7/9 loại (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Trung Quốc

22. 56/89 loại (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Trung Quốc

23. 4/28 loạt (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Trung Quốc

24. 14/1 loạt (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Trung Quốc

25. K/tím loại (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Trung Quốc

26. SFS 150 nhiều (giới thiệu từ Malawi) TRFK, Kericho, Kenya Assam

27. 430/43 loạt (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Assam

28. BB7 loạt (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Assam

29. BB21 loạt (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Assam

30. BB35 loạt (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Assam

31. TN 14/3 loạt (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Trung Quốc

32. 471/15 loại (lựa chọn) TRFK, Kericho, Kenya Assam

Tây Bengal, Ấn Độ

Coimbatore, Ấn Độ

Tây Bengal, Ấn Độ

Ấn Độ

MseI 3 lớp lót M32: GATGAGTCCTGAGTAAAAC-5 ' 3 '

M39: GATGAGTCCTGAGTAAAGA-5 ' 3 '

M47: GATGAGTCCTGAGTAACAA-5 ' 3 '

M55: GATGAGTCCTGAGTAACGA-5 ' 3 '

EO1, 75 ng mồi MO1, 1 U Taq DNA polymerase (Perkin Elmer,

Hoa Kỳ), 2.5 μl 10 × PCR đệm (Perkin Elmer, Hoa Kỳ) và cách 0.2 mM

dNTPs, trong một tập cuối cùng của 24 μl. Phản ứng của Đảng Cộng sản Romania được thực hiện

trong một Perkin Elmer-9600 nhiệt người đạp xe máy (Perkin Elmer, Mỹ) bằng cách sử dụng

hồ sơ nhiệt độ sau đây: các chu kỳ 30 30 s tại 94° C, 30 s

ở 60° C, 60 s ở 72° C. Sau khi tiền khuếch đại 55 μl TO.1E đệm

(10 mM TRIS, pH 8.0, 0,1 mM EDTA) đã được thêm vào mỗi mẫu và

nơi một smear (cách 0.2 kb) là có thể nhìn thấy.

kết thúc ghi nhãn

chỉ EcoRI tương thích chất nền, mồi được gắn nhãn. Đủ mồi là

chuẩn bị cho 35 amplifications chọn lọc bằng cách kết hợp 3.5 μl δ-[33 P]

ATP (1.11 × 1014 Bq/mmol), 3.5 μl 10 × T4 đệm (250 mM TRIS-
HCl, pH 7.5, 100 mM MgCl2, 50 mM DTT, 5 mM spermidine),

7.5 μl E (cộng với ba chọn lọc nucleotide) mồi (50 ng/μl cổ),

0.9 μl T4 kinase (10 đơn vị/ml) và 22,4 μl H2O (cuối cùng khối lượng 35 μl).

mẫu đã được ủ tại 37 ° C trong 30 phút sau đó đun nóng đến 70 ° C cho

chọn lọc PCR amplifications

chọn lọc hạn chế mảnh khuếch đại được thực hiện với một

(Table 2). Mỗi phản ứng PCR 20 μl bao gồm 3 μl khuếch đại trước

DNA, 50 ng với nhãn hiệu EcoRI 3 mồi, 50 ng unlabelled EcoRI 3

mồi, 50 ng unlabelled MseI 3 mồi, 2 mM dNTP, cách 0.1 μl Taq

DNA polymerase (10 đơn vị/μl) và 2 μl PCR đệm (Perkin Elmer,

Hoa Kỳ). Tiểu sử chu kỳ sau đảm bảo tối ưu mồi selec-
cao: 1 chu kỳ 30 s tại 94° C, 30 s ở 65° C, 60 s tại 72° C tiếp là

bởi các chu kỳ 11 cách 0.7° c thấp ủ nhiệt độ mỗi chu kỳ và

The PCR sản phẩm được trộn với 20 μl formamide nạp đệm

(98% formamide, EDTA 10 mM, 0,005% mỗi Xylen cyanol FF

và bromophenol màu xanh) và denatured bởi ấp cho 5 phút tại

90° C. 6% polyacrylamide gel đã được chuẩn bị bằng cách trộn 65 ml

6% Easigel (Scotlab) và 450 μl 10% amoni persulphate, de-
gassing và thêm 20 μl TEMED. Các gel được đổ ít 4 h

trước khi sử dụng và trước khi chạy lúc 80 W cho 30 phút mẫu của 5 μl

nạp một theo dõi và gel đã được điều hành cho 1,45 h tại 80 W, chuyển sang

3LI sắc kí giấy và khô trên một gel khô cho 2 h tại 80 ° C.

ban nhạc đã được ghi là trình bày hoặc vắng mặt trên autorads. Mức độ của

đa hình được định lượng của Shannon chỉ số của kiểu hình dùng

nơi pi là tần số của kiểu hình tôi (King và Schaal 1989). Ho

được sự đa dạng tính từ p kiểu hình tần số trong tất cả

quần thể được coi là với nhau. Sau đó tỷ lệ diver-
sity hiện nay trong quần thể, Hpop/Hsp, có thể được so sánh với

Các ước tính của giống nhau giữa kiểu gen được dựa trên các

xác suất một mảnh khuếch đại từ một quá trình gia nhập sẽ cũng