The quality and concentration of th

The quality and concentration of the total RNA was examined by agarose gel elec- trophoresis and by a spectrophotometer after processing with 1 U DNase I (Promega) at 37 C for 15 min to remove the trace amounts of genomic DNA. The concentration of each sample was then adjusted to the same level and stored at 80 C until the following experiment.

4.4. Subtractive hybridization

DSN-mediated normalization and subtractive hybridization (DNSH) was carried out following the method of Dai et al. [22], but with minor modifications. The primer pairs used in the DNSH method were the same as those in Dai’s study (for sequence information about the primers, see Table 1 in Dai et al. [22]). The efficiency of the subtractive hybridization was examined by amplifying the GAPDH gene using primer pairs GAPDH-F
(50 -GCCATCGCTATCTCCCTG-30 ) and GAPDH-R (50 -CCAGAAGTCA-
CAAACGCCTC-30 ).

4.5. Sequence analysis and blast search

After three rounds of PCR, >500 bp fragments were purified using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). The products were then ligated with the vector pUCm-T (Takara). The PCR products of the plasmids were extracted from Escherichia coli culture using white colonies as inocula after blue/white screening. These plasmids were manipulated based on primer pairs M13F (50 -GTAAAACGACGGC CAG-30 ) and M13R (50 -CAGGAAACAGCTATGAC-30 ).

Kết quả (Việt) 2:

Chất lượng và sự tập trung của tổng RNA đã được kiểm tra bởi agarose gel trophoresis thống điện và bằng máy quang phổ sau khi xử lý với 1 U DNase I (Promega) ở 37 C trong 15 phút để loại bỏ các dấu vết số tiền của DNA. Nồng độ của mỗi mẫu sau đó đã được điều chỉnh để cùng cấp và bảo quản ở 80 C cho đến khi các thí nghiệm sau. 4.4. Trừ lai DSN qua trung gian bình thường và lai trừ (DNSH) được thực hiện theo phương pháp của Đại et al. [22], nhưng với phụ cation Modi fi. Các cặp mồi sử dụng trong phương pháp DNSH là giống như những người trong nghiên cứu của Đại (để biết thông tin về trình tự mồi, xem Bảng 1 ở Đại et al. [22]). Các fi ciency ef của lai trừ đã được kiểm tra bằng cách khuếch đại gen GAPDH sử dụng cặp mồi GAPDH-F (50 -GCCATCGCTATCTCCCTG-30) và GAPDH-R (50 -CCAGAAGTCA- CAAACGCCTC-30). 4.5. Phân tích trình tự và tìm kiếm vụ nổ Sau ba vòng của PCR,> 500 mảnh bp là puri fi ed sử dụng Kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Các sản phẩm này sau đó được ligated với vector pUCm-T (Takara). Các sản phẩm PCR của plasmid được trích xuất từ Escherichia coli văn hóa sử dụng khuẩn lạc màu trắng như inocula sau màu xanh / sàng lọc trắng. Những plasmid được chế tác dựa trên các cặp mồi M13F (50 -GTAAAACGACGGC CAG-30) và M13R (50 -CAGGAAACAGCTATGAC-30).