while MDH may have a role in oxidat

while MDH may have a role in oxidative metabolism as well
as other physiological functions, depending on its biochemical
characteristics and intracellular localization [8]. LDHs
are cytosolic proteins but isoforms of MDH have been
localized to the cytosol as well as different subcellular
organelles such as mitochondria, chloroplast, peroxysomes
and glyoxysomes [8]. LDHs and MDHs characterized from
different organisms form a large superfamily [9]. A specific
phylogenetic distribution of LDH, LDH-like MDH and
dimeric MDH over the Archaeal, Bacterial and Eukaryal
domains was observed. All LDHs and MDHs enzymes
from apicomplexan parasites, which include Plasmodium
spp., Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum and
Eimeria tenella, were found to be monophylectic within
the
LDH-like MDH group as a sister to alpha-proteobacterial
MDHs [10]. All of the apicomplexan LDHs, with the
exception of LDH1 from Cryptosporidium parvum, form a
separate clade from their MDH counterparts, indicating
that these LDHs evolved from an ancestral apicomplexan
MDH by gene duplication and functional conversion before
expansion of apicomplexans [10,11]. Both LDH and MDH
from various organisms have been characterized in considerable
detail at the molecular and structural levels
[6,7,12,13]. However, only LDH from P. falciparum
(PfLDH) has been characterized in significant detail,
including determination of its crystal structure. The enzyme
has also been exploited as a potential target for design and
development of specific enzyme inhibitors as antimalarial
agents [14–17]. A comparative kinetic and structural
analysis of LDH from all four species of human malaria
parasite has also been reported recently [18]. However,
MDH, which catalyses reversible conversion of malate to
oxaloacetate (OAA) using NAD(P) as a cofactor, has not
been characterized in sufficient detail from P. falciparum. It
was shown previously that P. falciparum contained a single
isozyme of MDH (PfMDH) which was suggested to be
localized to the cytosol of the parasite [19]. The avian
malaria parasite P. lophurae was also found to contain a
single isozyme of MDH which was distinct from host
erythrocyte MDH [20]. Alternatively, P. berghei the rodent
malaria parasite has been shown to have multiple MDH
isozymes [21]. However, the presence of multiple MDH
isoforms in mouse erythrocytes, the preference of P. berghei
to infect reticulocytes, and the detection of low activity of
MDH in P. bergheiraises questions regarding the validity of
this report. The recent release of the P. falciparum genome
sequence has indicated the presence of a gene putatively
encoding for MDH [4]. Initial analysis of the PfMDH
sequence revealed its higher homology with the MDH
sequences from a-proteobacteria and also with LDHs.
PfMDH may therefore be classified as LDH-like MDH,
similar to that from other apicomplexan parasites [10,11].
In this study PfMDH was cloned from P. falciparum
genomic DNA and total RNA by PCR and RT-PCR,
overexpressed in Escherichia coli and the recombinant
enzyme was purified to homogeneity. Functional characterization
of the recombinant PfMDH protein was carried
out by analysis of its biochemical characteristics and enzyme
kinetics. Expression of MDH in P. falciparum was found to
be developmentally regulated during its growth and proliferation
in human erythrocytes. A highly refined homology
model for PfMDH was also constructed on the basis of
crystal structures of nearest structural homologues i.e.
PfLDH [14], E. coli MDH [22] and Chlorobium tepidum
MDH [23]. High homology of PfMDH with PfLDH also
prompted us to ask whether MDH can complement the
function of LDH in the malaria parasite. This was studied
by treating the P. falciparum cultures with gossypol, an
inhibitor of LDH, which has also shown antimalarial
action [24].
Materials and methods
P. falciparum (D6 strain) was grown in vitro in RPMI 1640
medium with A+ human red blood cells (RBCs) and A+
human serum as described previously [25]. For large-scale
culture the parasite was grown in 75 cm2 culture flasks,
which can accommodate up to 200 mL of culture medium.
The parasite was grown in 24 culture flasks to
10–15%
parasitemia. The cultures were highly synchronized with
two/three cycles of sorbitol treatment [26]. The parasite
cultures initiated with early ring stage were harvested at
regular 8 h intervals starting from 0 to 40 h to isolate the
parasite at different developmental stages of life cycle viz.,
early rings, late rings, early trophozoites, late trophozoites,
early schizonts and late/mature schizonts. The RBC-free
parasite was prepared by lysis of infected RBCs with
saponin [27]. Genomic DNA and RNA were prepared by
using a genomic DNA isolation kit (Qiagen) and trizol
method (Invitrogen), respectively, as per the manufacturer’s
protocol.
Cloning of Pf MDH, Pf LDH and Pf MQO
PfMDH was cloned for functional and biochemical
characterization. The other two genes PfLDH and
PfMQO were also cloned to obtain the

Kết quả (Việt) 1:

trong khi MDH có thể có một vai trò trong trao đổi chất oxy hóanhư các chức năng sinh lý, tùy thuộc vào hóa sinh của nóđặc điểm và bản địa hóa nội bào [8]. LDHsnhững protein cytosolic nhưng isoforms MDH đãbản địa hoá là thích cũng như khác nhau củacác bào quan như ti thể, Lạp lục, peroxysomesvà glyoxysomes [8]. LDHs và MDHs đặc trưng từsinh vật khác nhau tạo thành một siêu họ lớn [9]. Một cụ thểphát sinh loài phân phối của LDH, LDH như MDH vàdimeric MDH hơn vi khuẩn cổ, vi khuẩn và Eukaryaltên miền được quan sát thấy. Tất cả các enzym LDHs và MDHstừ apicomplexan ký sinh trùng, trong đó bao gồm Plasmodiumspp., Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum vàEimeria tenella, đã được tìm thấy sẽ là monophylectic trong vòngNhóm giống như LDH MDH là chị em với alpha-proteobacterialMDHs [10]. Tất cả các apicomplexan LDHs, với cácngoại lệ LDH1 từ Cryptosporidium parvum, dưới hình thức mộtphân nhánh từ các đối tác MDH, chỉ raCác LDHs đã tiến hóa từ một tổ tiên apicomplexanMDH gen sao chép và chuyển đổi chức năng trước khisự mở rộng của apicomplexans [10,11]. LDH và MDHtừ sinh vật khác nhau đã được đặc trưng trong đáng kểCác chi tiết ở mức phân tử và cấu trúc[6,7,12,13]. Tuy nhiên, chỉ LDH từ P. falciparum(PfLDH) đã được đặc trưng trong các chi tiết quan trọng,trong đó xác định cấu trúc tinh thể của nó. Enzymecũng đã được khai thác như một mục tiêu tiềm năng cho thiết kế vàphát triển của thuốc ức chế enzym cụ thể như antimalarialĐại lý [14-17]. Một so sánh kinetic và cấu trúcphân tích của LDH từ tất cả bốn loài người bệnh sốt rétký sinh trùng cũng đã được báo cáo gần đây [18]. Tuy nhiên,MDH, mà chuyển đổi đảo ngược catalyses malate đểoxaloacetate (OAA) bằng cách sử dụng NAD(P) như một cofactor, không cóđặc điểm chi tiết đầy đủ từ P. falciparum. Nóđược hiển thị trước đó rằng P. falciparum chứa một đĩa đơnisozyme MDH (PfMDH) đã được đề xuất làbản địa hoá cho thích của ký sinh trùng [19]. Các dịch cúm gia cầmbệnh sốt rét ký sinh trùng P. lophurae cũng được tìm thấy có chứa mộtđơn isozyme MDH là khác biệt với máy chủ lưu trữerythrocyte MDH [20]. Ngoài ra, P. berghei động vật gặm nhấmký sinh trùng sốt rét đã được chứng minh có nhiều MDHisozymes [21]. Tuy nhiên, sự hiện diện của nhiều MDHisoforms ở chuột hồng cầu, sở thích của P. bergheiđể lây nhiễm reticulocytes, và phát hiện các hoạt động thấp củaMDH P. bergheiraises câu hỏi liên quan đến hiệu lực củabáo cáo này. Phát hành gần đây của bộ gen P. falciparumtrình tự đã chỉ ra sự hiện diện của một gen putativelymã hóa cho MDH [4]. Các phân tích ban đầu của PfMDHtrình tự tiết lộ của nó tương đồng cao với MDHtrình tự từ a-sơ và cũng có thể với LDHs.PfMDH do đó có thể được phân loại là giống như LDH MDH,tương tự như từ khác ký sinh trùng apicomplexan [10,11].Trong nghiên cứu này PfMDH nhân bản từ P. falciparumgen DNA và RNA tất cả bằng PCR và RT-PCR,overexpressed trong Escherichia coli và sự tái tổ hợpmen tiêu hóa tinh khiết để tính đồng nhất. Các đặc tính chức năngcủa PfMDH tái tổ hợp protein được thực hiệnra bằng cách phân tích các đặc điểm sinh hóa và enzyme của nóđộng học. Biểu hiện của MDH ở P. falciparum đã được tìm thấyphaùt được quy định trong tăng trưởng và phát triển của nótrong hồng cầu của con người. Homology rất tinh tếMô hình cho PfMDH cũng được xây dựng trên cơ sở củacấu trúc tinh thể của cấu trúc lớn gần nhất tức làPfLDH [14], E. coli MDH [22] và Chlorobium tepidumMDH [23]. Cao tính tương đồng của PfMDH với PfLDH cũngnhắc nhở chúng tôi để yêu cầu cho dù MDH có thể bổ sung cácchức năng của LDH trong ký sinh trùng sốt rét. Điều này đã được nghiên cứubằng cách điều trị các nền văn hóa P. falciparum với gossypol, mộtchất ức chế của LDH, cũng đã cho thấy biếnhành động [24].Vật liệu và phương phápP. falciparum (D6 căng) đã được trồng trong ống nghiệm ở RPMI 1640vừa với một + nhân tế bào máu đỏ (RBCs) và A +con người huyết thanh như mô tả trước đó [25]. Đối với quy mô lớnvăn hóa ký sinh trùng đã được trồng ở 75 cm2 văn hóa bình,mà có thể chứa lên đến 200 mL của văn hoá phương tiện.Ký sinh trùng đã được trồng ở 24 văn hóa bình 10-15%parasitemia. Các nền văn hóa rất đồng bộ hoá với2/3 các chu kỳ điều trị sorbitol [26]. Ký sinh trùngbắt đầu với giai đoạn vòng các nền văn hóa đã được thu hoạch tạikhoảng thời gian thường xuyên 8 h bắt đầu từ 0 đến 40 h để cô lập cácký sinh trùng ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cuộc sống chu kỳ viz.,vòng đầu, vòng cuối, đầu trophozoites, trễ trophozoites,đầu schizonts và schizonts vào cuối/trưởng thành. RBC-miễn phíký sinh trùng đã được chuẩn bị bởi lysis của RBCs bị nhiễm bệnh vớisaponin [27]. DNA và RNA gen đã được chuẩn bị bởibằng cách sử dụng một gen DNA isolation kit (Qiagen) và trizolphương pháp (Invitrogen), tương ứng, theo các nhà sản xuấtgiao thức.Nhân bản vô tính Pf MDH, Pf LDH và Pf MQOPfMDH đã được nhân bản cho các chức năng và sinh hóađặc tính. Các khác hai Gene PfLDH vàPfMQO đã được nhân bản cũng có được những

Kết quả (Việt) 2:

trong khi MDH có thể có một vai trò trong sự trao đổi chất oxy hóa cũng
như các chức năng sinh lý khác, tùy thuộc vào sinh hóa của nó
đặc điểm và nội địa hóa trong tế bào [8]. LDHs
là các protein cytosolic nhưng đồng dạng của MDH đã được
bản địa hoá để bào tương cũng như dưới tế bào khác nhau
bào quan như ti thể, lục lạp, peroxysomes
và glyoxysomes [8]. LDHs và MDHs đặc trưng từ
các sinh vật khác nhau tạo thành một siêu họ lớn [9]. Một cụ
phân phối phát sinh loài của LDH, MDH LDH giống và
dime MDH trong archaea, vi khuẩn và Eukaryal
lĩnh vực được quan sát thấy. Tất cả LDHs và enzyme MDHs
từ ký sinh trùng apicomplexan, trong đó bao gồm Plasmodium
spp., Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum và
Eimeria tenella, đã được tìm thấy là monophylectic trong
LDH giống như nhóm MDH sự? Như em gái để alpha-proteobacterial
MDHs [10]. Tất cả các LDHs apicomplexan, với
ngoại lệ của LDH1 từ Cryptosporidium parvum, tạo thành một
nhánh riêng biệt từ các đối tác MDH họ, cho thấy
rằng những LDHs tiến hóa từ một tổ tiên apicomplexan
MDH bằng cách nhân gen và chuyển đổi chức năng trước khi
mở rộng apicomplexans [10,11]. Cả hai LDH và MDH
từ sinh vật khác nhau đã được đặc trưng trong đáng kể
chi tiết ở cấp phân tử và cấu trúc
[6,7,12,13]. Tuy nhiên, chỉ có LDH từ P. falciparum
(PfLDH) đã được đặc trưng trong chi tiết quan trọng,
bao gồm cả việc xác định cấu trúc tinh thể của nó. Các enzyme
cũng đã được khai thác như một mục tiêu tiềm năng cho thiết kế và
phát triển các thuốc ức chế enzyme cụ thể như sốt rét
đại lý [14-17]. Một động học và cấu trúc so sánh
phân tích của LDH từ tất cả bốn loài sốt rét
ký sinh trùng cũng đã được báo cáo gần đây [18]. Tuy nhiên,
MDH, xúc tác chuyển đổi thuận nghịch malate để
oxaloacetate (OAA) sử dụng NAD (P) như một đồng yếu tố, đã không
được đặc trưng đầy đủ chi tiết từ P. falciparum. Nó
được thể hiện trước đây cho rằng P. falciparum chứa một đơn
isozyme của MDH (PfMDH) mà đã được đề xuất để được
khu trú trong bào tương của các ký sinh trùng [19]. Các gia cầm
mắc bệnh sốt rét ký sinh trùng P. lophurae cũng đã được phát hiện có chứa một
isozyme duy nhất của MDH đó là khác biệt từ máy chủ
của hồng cầu MDH [20]. Ngoài ra, P. berghei các động vật gặm nhấm
ký sinh trùng sốt rét đã được chứng minh là có nhiều MDH
isozyme [21]. Tuy nhiên, sự hiện diện của nhiều MDH
đồng dạng trong hồng cầu chuột, sở thích của P. berghei
để lây nhiễm hồng cầu lưới, và phát hiện các hoạt động thấp của
MDH P. bergheiraises câu hỏi về tính hợp lệ của
báo cáo này. Việc phát hành gần đây của bộ gen P. falciparum
tự đã chỉ ra sự hiện diện của một gen putatively
mã hóa cho MDH [4]. Phân tích ban đầu của PfMDH
trình tự tiết lộ tương đồng cao với các MDH
trình tự từ một-proteobacteria và cũng với LDHs.
PfMDH do đó có thể được phân loại như LDH-như MDH,
tương tự như từ ký sinh trùng apicomplexan khác [10,11].
Trong nghiên cứu này PfMDH đã được nhân bản từ P. falciparum
DNA và RNA PCR và RT-PCR,
quá mức trong Escherichia coli và tái tổ hợp
enzyme đã được thanh tẩy để đồng nhất. Đặc tính chức năng
của protein tái tổ hợp PfMDH được thực
hiện bằng cách phân tích các đặc điểm sinh hóa và enzyme
động học. Biểu hiện của MDH P. falciparum đã được tìm thấy để
được điều chỉnh mặt phát triển trong sự phát triển và phổ biến của nó
trong hồng cầu của con người. Một tương đồng rất tinh tế
mô hình cho PfMDH cũng được xây dựng trên cơ sở
cấu trúc tinh thể của tương đồng về cấu trúc khu vực gần nghĩa
PfLDH [14], E. coli MDH [22] và Chlorobium tepidum
MDH [23]. Tương đồng cao với PfMDH PfLDH cũng
nhắc nhở chúng ta đặt câu hỏi liệu MDH có thể bổ sung các
chức năng của LDH trong ký sinh trùng sốt rét. Điều này đã được nghiên cứu
bằng cách xử lý các nền văn hóa P. falciparum với gossypol, một
chất ức chế của LDH, cũng đã cho thấy sốt rét
hành động [24].
Vật liệu và phương pháp
P. falciparum (D6 căng) được trồng trong ống nghiệm trong môi trường RPMI 1640
trung bình với con người tế bào A + đỏ máu (hồng cầu) và A +
huyết thanh người như mô tả trước đây [25]. Đối với quy mô lớn
văn hóa các ký sinh trùng được trồng trong bình nuôi cấy 75 cm2,
với sức chứa lên đến 200 ml môi trường nuôi.
Các ký sinh trùng được trồng ở 24 bình nuôi cấy để? 10-15%
KST. Các nền văn hóa đã rất đồng bộ với
hai / ba chu kỳ điều trị sorbitol [26]. Ký sinh trùng
nền văn hóa bắt đầu với giai đoạn vòng đầu được thu hoạch vào
khoảng 8 h thường bắt đầu từ 0-40 h để cô lập các
ký sinh trùng ở các giai đoạn phát triển khác nhau của chu kỳ cuộc sống viz.,
Vòng đầu, vòng cuối, thể tư dưỡng sớm, trophozoites muộn,
phân liệt sớm và cuối / phân liệt trưởng thành. RBC miễn
ký sinh trùng được chuẩn bị bởi ly giải tế bào hồng cầu bị nhiễm với
saponin [27]. Genomic DNA và RNA đã được chuẩn bị bằng cách
sử dụng một sự cô lập bộ gen DNA (Qiagen) và trizol
phương pháp (Invitrogen), tương ứng, theo các nhà sản xuất
giao thức.
Cloning của Pf MDH, Pf LDH và Pf MQO
PfMDH đã được nhân bản cho các chức năng sinh hóa và
đặc tính. Hai gen khác PfLDH và
PfMQO cũng đã được nhân bản vô tính để có được