PCR-DGGE fingerprinting, coupled wi

PCR-DGGE fingerprinting, coupled with statistical analysis and calculation of biodiversity indexes, was used by Ampe and Miambi (2000) to differentiate bacterial communities occurring in different types of fermented maize foodstuffs. Degrees of microbial diversity were determined for each food sample. The approach also allowed to distinguish the products on the basis of their mode of production and some species of LAB as particularly adapted to maize fermentations. The use of PCR-DGGE has been also exploited to monitor the hygienic quality of mineral waters (Dewettinck et al., 2001). The study showed that different fingerprints could be obtained from ground water and commercial bottled mineral waters, and evidenced the occurrence of unculturable microorganisms in the samples. Dewettinck et al. (2001) also experimented a resuscitation procedure of the microbial flora prior to DNA extraction, showing that it could either improve or decrease the number of bands detectable. Foods with a defined microbial flora, produced by using starter cultures and/or in controlled conditions, are the easiest matrices to control as they usually display a simple DGGE profile where each band corresponds to the species expected to be there. Among these are yoghurts and probiotics beverages or preparations. Recently, PCR-DGGE was shown to be effective in corroborating the occurrence of certain microbial species in yoghurt and lyophilised probiotic preparations (Fasoli et al., 2003; Temmerman et al., 2003). A general congruence between microorganisms declared on the label and those revealed by PCR-DGGE was found by Fasoli et al. (2003) for probiotic yoghurts. However, the authors also found some discrepancies for probiotic preparations such as incorrect identification of some Bacillus and Bifidobacterium species and the presence of microbial entities not declared in the label (Fasoli et al., 2003). These results are consistent with those obtained by Temmerman et al. (2003), analysing several probiotic preparations by PCR-DGGE; the authors found the technique very useful in verifying the occurrence of probiotics in the analysed matrices, especially if compared to the long and uncertain traditional procedures. The PCRDGGE control of such products rapidly and reliably revealed a rather high percentage of probiotic products suffering from incorrect labelling and viable counts often showed low loads of the declared species, thus compromising the probiotic value of the products (Temmerman et al., 2003).
10. Acknowledged pitfalls of the technique
Methods can carry bias and molecular techniques, although avoiding some of the drawbacks of traditional procedures can also have disadvantages. This paragraph will describe the possible pitfalls of the whole procedure when applied to food products. Biases may already be introduced by sampling and sample handling; such biases are frequent in traditional as well as molecular methods. Aerobic or anaerobic storage, washing, transport, freezing, or refrigerating procedures may affect the development of the microbial species occurring in the food by increasing or reducing the number and the species to be detected. Further source of variability can be DNA extraction. Purification of nucleic acids can sometimes be very difficult as foods are not simple matrices. Not all the species, in fact, have the same sensitivity to the lytic agents and the differences are mainly due to the organisation of the cell wall. Obviously, this affects the analyses based on the in situ DNA extraction because a high yield in DNA is desired as well as the detection of all the species occurring in that environment. Selection can be introduced by the DNA extraction when it is applied to mixed bacterial cultures where it is very difficult to extract DNA from all the species with the same efficiency. The different amounts of the species present in the original sample can also affect the concentration of the DNA extracted and its detectability. Moreover, the more complex is the matrix, the more difficult it is to achieve good extraction and to get rid of all the impurities that can negatively affect the amplification step. The case of food matrices is particularly difficult; in fact, the presence of natural constituents such as lipids, proteins, carbohydrates, and salts, may render the DNA extraction very hard and some of these molecules can persist until the end of the extraction and are found in the extract. When the DNA extracted is used as template for the PCR, the matrix residues might act as inhibitors (Wilson, 1997). Therefore, the DNA extraction procedure needs to be optimised in order to (i) obtain the highest yield in extraction, and (ii) achieve the right degree of purification to have a DNA pure enough to be used as template for PCR reactions.

Kết quả (Việt) 2:

PCR-DGGE fingerprinting, kết hợp với phân tích thống kê và tính toán các chỉ số đa dạng sinh học, đã được sử dụng bởi Ampe và Miambi (2000) để phân biệt các cộng đồng vi khuẩn xảy ra trong các loại thực phẩm lên men ngô. Độ đa dạng vi sinh vật đã được xác định cho từng mẫu thức ăn. Phương pháp này cũng cho phép phân biệt các sản phẩm trên cơ sở chế độ sản xuất của mình và một số loài LAB là đặc biệt thích nghi với quá trình lên men ngô. Việc sử dụng PCR-DGGE cũng đã được khai thác để giám sát chất lượng vệ sinh nước khoáng (Dewettinck et al., 2001). Nghiên cứu cho thấy dấu vân tay khác nhau có thể được lấy từ nguồn nước ngầm và nước khoáng đóng chai thương mại, và bằng chứng là sự xuất hiện của vi sinh vật không nuôi cấy trong các mẫu. Dewettinck et al. (2001) cũng đã thử nghiệm một thủ tục hồi sức của hệ vi khuẩn trước khi khai thác DNA, cho thấy rằng nó có thể hoặc cải thiện hoặc giảm số lượng của các ban nhạc được phát hiện. Thực phẩm có một hệ vi khuẩn được xác định, được sản xuất bằng cách sử dụng các nền văn hóa khởi động và / hoặc trong điều kiện kiểm soát, là ma trận đơn giản nhất để kiểm soát khi họ thường hiển thị một hồ sơ DGGE đơn giản, nơi mỗi băng tần tương ứng với các loài dự kiến sẽ có mặt ở đó. Trong số này có sữa chua và đồ uống chế phẩm sinh học, chế phẩm. Gần đây, PCR-DGGE đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc bổ chứng sự xuất hiện của các loài vi sinh vật nào đó trong sữa chua và các chế phẩm probiotic đông khô (Fasoli et al 2003,;. Temmerman et al., 2003). Một congruence chung giữa vi sinh vật công bố trên nhãn và những tiết lộ của PCR-DGGE đã được tìm thấy bởi Fasoli et al. (2003) cho sữa chua probiotic. Tuy nhiên, các tác giả cũng tìm thấy một số khác biệt đối với các chế probiotic như không xác định đúng của một số vi khuẩn Bacillus và Bifidobacterium loài và sự hiện diện của các tổ chức vi sinh vật không được khai báo trong nhãn (Fasoli et al., 2003). Những kết quả này phù hợp với những người thu được bởi Temmerman et al. (2003), phân tích một số chế phẩm probiotic bằng PCR-DGGE; các tác giả thấy kỹ thuật này rất hữu ích trong việc xác nhận sự xuất hiện của chế phẩm sinh học trong các ma trận phân tích, đặc biệt là nếu so với các thủ tục truyền thống lâu dài và không chắc chắn. Việc kiểm soát PCRDGGE của các sản phẩm nhanh chóng và đáng tin cậy tiết lộ một tỷ lệ khá cao của các sản phẩm probiotic bị ghi nhãn không chính xác và tính khả thi thường cho thấy tải trọng thấp của các loài tuyên bố, do đó ảnh hưởng đến giá trị của các sản phẩm probiotic (Temmerman et al., 2003).
10. Cạm bẫy thừa nhận của kỹ thuật
phương pháp có thể thực hiện thiên vị và các kỹ thuật phân tử, mặc dù tránh được một số nhược điểm của các thủ tục truyền thống cũng có thể có nhược điểm. Khoản này sẽ mô tả những cạm bẫy có thể có của toàn bộ thủ tục khi áp dụng cho các sản phẩm thực phẩm. Những thành kiến có thể đã được giới thiệu bằng cách lấy mẫu và xử lý mẫu; những thành kiến như vậy là thường xuyên trong truyền thống cũng như các phương pháp phân tử. Aerobic hoặc kỵ khí quản, giặt, vận chuyển, làm lạnh, hoặc lạnh thủ tục có thể ảnh hưởng sự phát triển của các loài vi sinh vật xảy ra trong thực phẩm bằng cách tăng hoặc giảm số lượng và các loài được phát hiện. Hơn nữa nguồn của sự biến đổi có thể được chiết xuất DNA. Thanh lọc axit nucleic đôi khi có thể rất khó khăn như các loại thực phẩm không phải là ma trận đơn giản. Không phải tất cả các loài, trong thực tế, có sự nhạy cảm cùng với các đại lý lytic và sự khác biệt chủ yếu là do các tổ chức của các tế bào. Rõ ràng, điều này ảnh hưởng đến những phân tích dựa trên in situ chiết DNA vì năng suất cao trong DNA được mong muốn cũng như sự phát hiện của tất cả các loài xảy ra trong môi trường đó. Lựa chọn có thể được giới thiệu bởi các chiết DNA khi nó được áp dụng cho hỗn hợp nuôi cấy vi khuẩn mà nó là rất khó khăn để trích xuất ADN từ tất cả các loài có cùng một hiệu quả. Các khoản khác nhau của các loài hiện diện trong mẫu ban đầu cũng có thể ảnh hưởng đến nồng độ của các DNA chiết xuất và detectability của nó. Hơn nữa, sự phức tạp hơn là các ma trận, các khó khăn hơn là để đạt được khai thác tốt và để có được thoát khỏi tất cả các tạp chất có thể ảnh hưởng tiêu cực đến các bước khuếch đại. Trường hợp của ma trận thực phẩm đặc biệt khó khăn; trên thực tế, sự hiện diện của các thành phần tự nhiên như chất béo, protein, carbohydrate, và muối, có thể làm cho quá trình chiết DNA rất khó khăn và một số những phân tử có thể tồn tại cho đến khi kết thúc khai thác và được tìm thấy trong dịch chiết. Khi DNA chiết xuất được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR, các dư lượng ma trận có thể hoạt động như chất ức chế (Wilson, 1997). Do đó, các thủ tục tách chiết DNA cần được tối ưu hóa nhằm (i) có được năng suất cao nhất trong khai thác, và (ii) đạt được mức độ phải của thanh lọc để có một DNA khiết đủ để được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.