In Vitro CultureIn vitro culture is

In Vitro Culture

In vitro culture is the process of preserving the normal phenotypic properties of a cell population or tissue for extended times at physiological temperatures by replicating ex vivo the native environment. As cell proliferation and differ- entiation is dependent on the physical environment [6] and is regulated by signals from soluble factors [7, 8], extracellular matrix proteins [9–11] and cell interactions [9, 12–15], tight control of these variables is essential for suc- cessful in vitro culture. Over the past century, efforts to identify key cell and tissue-specific physiological and physicochemical determinants have resulted in this technique being widely adopted by the basic sciences and the biotech- nology industry.
The ability to preserve cell viability and function ex vivo is an essen- tial technology used in basic and applied research. In vitro culture allows researchers to develop well-characterized, homogenous cell lines that can be perpetuated over several generations (primary cultures) or indefinitely (transformed or continuous cell lines). With standardized cell culture con- ditions, in vitro expansion of a uniform cell population can quickly pro- duce the necessary biological material to perform multiparameter studies and/or perform sensitive biochemical or genetic manipulation and analy- sis. In addition, culture of cells, native tissue or tissue explants allows for precise environmental control and manipulation, thereby minimizing ex- perimental variability. For these reasons, in vitro culture has been instru- mental in advancing virology [16], immunology [17], hematology [18], mo- lecular genetics [19], pharmacology [20] and other basic and applied disci- plines [21].
Large-scale in vitro culture and expansion of cells and tissues has been extensively used by the biotechnology industry for the production of com- mercial products. Vaccines, monoclonal antibodies, recombinant proteins, cytokines and other therapeutic agents are routinely produced from trans- fected prokaryotic and eukaryotic cells. Industrial microbiology [22] and mycology [23, 24] are used to manufacture a wide variety of products, includ- ing antibiotics, enzymes, amino acids, oligosaccharides, alcohols, insecticides and herbicides. In addition, commercial plant tissue culture produces a num-




ber of secondary products which are used in the food (i.e. flavouring agents) and pharmaceutical (i.e. terpenoids, quinines, lignans, flavonoids, alkaloids) industries [25, 26].

2.1
Trends in in Vitro Culture

The importance of in vitro culture to cell-based bioengineering and to the basic and applied sciences has been the motivation for active research in this area. Efforts to improve the productivity of large-scale cell culture have focused on engineering novel methods for the addition of nutrients, elimina- tion of waste, component mixing and aeration of the cultured cells. Continu- ous culture of suspension cells in fed-batch bioreactors [27–29], hollow-fibre perfusion systems [30, 31], fluidized bed reactors [32] or microgravity culture systems [33, 34] and the development of microcarriers [35] and large-surface- area culture devices for use with anchorage-dependent cells has allowed for significant scaling of production to be achieved. As it is becoming increas- ingly clear that the cellular microenvironment has an important role in cell function, efforts have been taken to better understand the role of soluble factors and cell–cell and cell–matrix interactions on cell proliferation and dif- ferentiation.
The addition of animal serum to culture media has traditionally been a requirement to maintain cells in vitro. Serum contains systemic compo- nents (nutrients, hormones, growth factors, protease inhibitors) involved in the homeostatic regulation of cell-cycle progression. However, the high cost and the fluctuating quality and composition of serum and the potential in- troduction of adventitious agents into the culture process has motivated the development of serum-free, animal protein-free media [36–38]. Identifying specific nonproteinaceous substitutes for the proteins in conventional media has been a challenge [37]. As a result, current chemically defined media are not protein-free, but rely on recombinant growth factors and hormones to eliminate components of animal or human origin [36].
Cell adhesion to extracellular matrices [39–41] and homotypic and het- erotypic cell–cell interactions [9, 15] are critical elements that modulate the genetic regulation of cell proliferation and differentiation. Studying the phe- notypic changes that accompany alterations to culture conditions has been an effective means to better understand the regulatory mechanisms respon- sible for “normal” function and to improve techniques for preserving the in vivo phenotype of cultured cells. Over the past few years, microfabrication technologies [42–44] have emerged as extremely useful tools for construct- ing patterned extracellular matrices and for controlling cell–cell interactions. This emerging technology has already significantly enhanced the in vitro preservation of hepatocytes [15] and neurons [45], and will continue to im- pact the preservation sciences [46].




2.2
In Vitro Culture of Engineered Cells and Tissues

Efforts have been made recently to extend the in vitro culture approach to clinically important cells and engineered tissues. In vitro culture is being de- veloped to preserve the cellular components used in the engineering of tissue constructs and for the ex vivo expansion of native and metabolically engi- neered and genetically engineered cells used in cellular therapies. A number of excellent reference texts have recently been published which discuss cur- rent methods used for the in vitro culture of a variety of different cells and engineered tissues [47, 48]. The development of dermal replacements and the ex vivo expansion of hematopoietic progenitor cells provide two examples of how this technology is being developed, and the impact it will have in clinical medicine.
Artificial skin substitutes were the first engineered tissue to be successfully constructed and preserved using in vitro culture [49, 50]. While the devel- opment of dermal models has traditionally been motivated by the clinical need for skin substitutes to treat traumatic skin defects (i.e. burns), there is considerable interest in using these engineered tissues to accelerate or manip- ulate the wound healing process [51], or as platforms for gene therapy [52]. The preservation and ex vivo expansion of human keratinocytes [50, 53, 54], fibroblasts [55], melanocytes [56, 57] and Langerhans cells [58] as purified monolayers in chemically defined media has allowed for the development of a number of artificial skin constructs [50, 59–62]. Typically, fibroblasts are cultured in a three-dimensional extracellular matrix, resulting in a simplified dermis that can be used as a foundation for the growth of a multilayered epi- dermis using keratinocytes. As a complex, interacting system, these dermal models have been used to study the relationship between the extracellu- lar matrix and fibroblast differentiation [63], and the role that fibroblasts have in remodelling the extracellular matrix [64] and promoting keratinocyte growth and differentiation [65, 66]. Understanding the ability of cell–cell and cell–matrix interactions to regulate cell proliferation and differentiation will advance wound healing research and have a dramatic effect on improving ex- isting methods for the in vitro culture of skin cells and engineered dermal replacements.
The capacity for hematopoietic progenitor cells to proliferate and differ- entiate into all of the blood cell lineages provides an attractive means to produce the cellular components needed for the treatment of a variety of ma- lignant and nonmalignant disorders. As the absolute number of hematopoi- etic cells found in mobilized peripheral blood, bone marrow or umbilical cord blood is low, there has been an active interest in developing in vitro culture methods that would selectively increase specific hematopoietic pro- genitors [18, 67]. With the identification and development of recombinant cy- tokines that can induce both proliferation and differentiation of hematopoi-




etic cells and the ability to selectively separate populations of progenitor and mature cells of interest, controlling the experimental conditions required to expand hematopoietic progenitor cells has been achieved [68, 69]. For example, the addition of the cytokines Flt-3 ligand, stem cell factor, throm- bopoietin and specific interleukins has been used to increase the number of long-term culture initiating cells from umbilical cord blood that are used in the repopulation of the bone marrow following myeloablative ther- apy [70–72]. The ex vivo expansion of megakaryocytic cells has been ac- tively pursued as a means to decrease the demand on donor-derived platelets used in the treatment of thrombocytopenia [73, 74]. Similarly, the ex vivo expansion of antigen-presenting dendritic cells [75] and cytotoxic lym- phocytes [76] is being explored owing to the potential use of these cells for immunotherapy. The ability to preserve the phenotypic properties of a hematopoietic cell population and to manipulate the differentiation of the cells into specific mature lineages demonstrates the significant progress that has been made in advancing in vitro culture technology.

2.3
Limitations of in Vitro Culture

While in vitro culture has been used effectively for the long-term preserva- tion of a wide variety of cells and tissues used in science and industry, it is not an ideal strategy for large-

Kết quả (Việt) 1:

Trong ống nghiệm văn hóaTrong ống nghiệm văn hóa là quá trình bảo quản các thuộc tính kiểu hình bình thường của dân di động hoặc mô cho mở rộng thời gian ở nhiệt độ sinh lý bằng cách sao chép cũ vivo môi trường bản địa. Như di động phổ biến vũ khí và entiation khác nhau phụ thuộc vào môi trường vật lý [6] và được quy định bởi các tín hiệu từ hòa tan yếu tố [7, 8], ngoại bào ma trận protein [9-11] và di động tương tác [9, 12-15], kiểm soát chặt chẽ của các biến này là điều cần thiết cho nền văn hóa trong ống nghiệm suc-cessful. Trong thế kỷ qua, những nỗ lực để xác định chính tế bào và mô-specific sinh lý và hóa lý yếu tố quyết định có kết quả trong kỹ thuật này được chấp nhận rộng rãi bởi các ngành khoa học cơ bản và ngành công nghiệp công nghệ sinh học-nology.Khả năng duy trì khả năng tồn tại của tế bào và các chức năng ví dụ vivo là một essen - chướng công nghệ được sử dụng trong nghiên cứu cơ bản và ứng dụng. Trong ống nghiệm văn hóa cho phép các nhà nghiên cứu để phát triển các dòng đầy đủ đặc trưng, đồng nhất di động có thể được kéo dài qua nhiều thế hệ (chính nền văn hóa) hoặc indefinitely (di động chuyển đổi hoặc liên tục dòng). Với di động tiêu chuẩn hóa văn hóa con-ditions, trong ống nghiệm mở rộng dân thống nhất di động có thể nhanh chóng pro-duce các vật liệu sinh học cần thiết để thực hiện các nghiên cứu multiparameter và/hoặc thực hiện nhạy cảm hóa sinh hoặc thao tác di truyền và analy-sis. Ngoài ra, văn hóa của tế bào, bản địa của mô hoặc mô explants cho phép cho chính xác kiểm soát môi trường và thao tác, do đó giảm thiểu biến đổi ex-perimental. Vì những lý do, trong ống nghiệm văn hóa đã là ph-tâm thần trong việc thúc đẩy virus [16], miễn dịch học [17], huyết học [18], mo-lecular di truyền học [19], dược lý học [20] và khác cơ bản và ứng dụng disci-plines [21].Nền văn hóa trong ống nghiệm quy mô lớn và mở rộng các tế bào và các mô đã được sử dụng rộng rãi bởi các ngành công nghiệp công nghệ sinh học để sản xuất com - mercial sản phẩm. Vắc xin, monoclonal kháng thể, tái tổ hợp protein, phân bào và các tác nhân điều trị thường xuyên được sản xuất từ tế bào so và sinh vật nhân chuẩn trans-fected. Vi sinh vật học công nghiệp [22] và mycology [23, 24] được sử dụng để sản xuất nhiều loại sản phẩm, thuốc kháng sinh bao gồm-ing, enzyme, amino axit, oligosaccharide, rượu, thuốc trừ sâu và chất diệt cỏ. Ngoài ra, nhà máy thương mại mô nền văn hóa sản xuất một số- BER sản phẩm thứ cấp được sử dụng trong thực phẩm (tức là các đại lý flavouring) và ngành công nghiệp dược phẩm (tức là terpenoid, quinines, lignans, flavonoids, ancaloit) [25, 26].2.1Xu hướng trong trong ống nghiệm văn hóaTầm quan trọng của văn hóa trong ống nghiệm di động dựa trên bioengineering và các ngành khoa học cơ bản và ứng dụng đã là động lực cho hoạt động nghiên cứu trong lĩnh vực này. Những nỗ lực để cải thiện năng suất của quy mô lớn di động văn hóa đã tập trung vào kỹ thuật tiểu thuyết phương pháp cho việc bổ sung các chất dinh dưỡng, elimina-tion của chất thải, thành phần pha trộn và thoáng nuôi cấy tế bào. Vẫn-Anh văn hóa của hệ thống treo các tế bào trong hàng loạt nuôi bioreactors [27-29], rỗng-fibre hệ thống truyền dịch [30, 31], fluidized giường lò phản ứng [32] hoặc hệ thống văn hóa microgravity [33, 34] và sự phát triển của microcarriers [35] và văn hóa lớn bề mặt diện tích thiết bị để sử dụng với anchorage-phụ thuộc vào các tế bào đã cho phép cho significant mở rộng quy mô sản xuất phải đạt được. Như nó là trở thành ng-ingly rõ ràng rằng microenvironment tế bào có một vai trò quan trọng trong chức năng tế bào, những nỗ lực đã được thực hiện để hiểu rõ hơn về vai trò của hòa tan yếu tố và tế bào-tế bào và tế bào-ma trận tương tác trên di động phổ biến vũ khí và b-ferentiation.Việc bổ sung các động vật huyết thanh để phương tiện truyền thông văn hóa có truyền thống là một yêu cầu để duy trì các tế bào trong ống nghiệm. Huyết thanh có chứa hệ thống dùng-nents (chất dinh dưỡng, kích thích tố, yếu tố tăng trưởng, ức chế protease) tham gia vào các quy định homeostatic của chu kỳ tế bào tiến triển. Tuy nhiên, chi phí cao và chất lượng fluctuating và các thành phần huyết thanh và tiềm năng trong-troduction của các đại lý adventitious vào quá trình văn hóa đã thúc đẩy việc phát triển huyết thanh miễn phí, động vật protein miễn phí phương tiện truyền thông [36-38]. Xác định specific nonproteinaceous thay thế cho các protein trong phương tiện truyền thông thông thường luôn là một thách thức [37]. Do đó, hiện tại hóa học defined phương tiện truyền thông không miễn phí protein, nhưng dựa trên yếu tố tăng trưởng tái tổ hợp và kích thích tố để loại bỏ các thành phần của nguồn gốc động vật hoặc con người [36].Tế bào bám dính ngoại bào ma trận [39-41] và tương tác tế bào-tế bào homotypic và het-erotypic [9, 15] những yếu tố quan trọng mà điều chỉnh các quy định di truyền của tế bào phát triển và sự khác biệt. Nghiên cứu những thay đổi phe-notypic mà đi kèm với thay đổi điều kiện văn hóa đã là một phương tiện hiệu quả tốt hơn để hiểu quy định cơ chế respon-Fremont cho chức năng "bình thường" và để cải thiện các kỹ thuật để duy trì các kiểu hình tại vivo nuôi cấy tế bào. Trong vài năm qua, công nghệ Mỹ phẩm [42-44] đã nổi lên như là công cụ rất hữu ích cho xây dựng-ing khuôn mẫu ngoại bào ma trận và cho việc kiểm soát các tế bào-tế bào tương tác. Công nghệ này đang nổi lên đã significantly tăng cường bảo tồn trong ống nghiệm hepatocytes [15] và tế bào thần kinh [45], và sẽ tiếp tục im-Hiệp ước các ngành khoa học bảo tồn [46]. 2.2Trong ống nghiệm văn hóa thiết kế các tế bào và các môNhững nỗ lực đã được thực hiện gần đây để mở rộng tiếp cận trong ống nghiệm văn hóa tế bào lâm sàng quan trọng và thiết kế mô. Trong ống nghiệm văn hóa đang là de-veloped để bảo tồn các thành phần di động được sử dụng trong kỹ thuật của mô xây dựng và cho ex vivo mở rộng bản địa và metabolically engi-neered và các biến đổi gen tế bào được sử dụng trong liệu pháp tế bào. Một số tài liệu tham khảo tuyệt vời văn bản gần đây đã xuất bản mà thảo luận về bệnh hoạn-thuê phương pháp được sử dụng cho nền văn hóa trong ống nghiệm một loạt các tế bào khác nhau và thiết kế mô [47, 48]. Sự phát triển của các thay thế và ex vivo mở rộng của các tế bào tạo máu tổ tiên cung cấp hai ví dụ về làm thế nào công nghệ này đang được phát triển, và tác động nó sẽ có trong y học lâm sàng.Artificial da sản phẩm thay thế đã là các mô chính thiết kế để thành công xây dựng và duy trì bằng cách sử dụng văn hóa trong ống nghiệm [49, 50]. Trong khi devel-opment của các mô hình có truyền thống được thúc đẩy bởi nhu cầu lâm sàng cho da sản phẩm thay thế để điều trị chấn thương tâm lý da Khuyết tật (tức là bỏng), không quan tâm đáng kể trong việc sử dụng các thiết kế mô để tăng tốc hoặc manip-ulate vết thương quá trình [51] chữa bệnh, hoặc như là nền tảng cho liệu pháp gen [52]. Việc bảo tồn và ex vivo mở rộng của con người keratinocytes [50, 53, 54], fibroblasts [55], melanocytes [56, 57] và các tế bào Langerhans [58] là purified monolayers trong hóa học defined phương tiện truyền thông đã cho phép cho sự phát triển của một số cấu trúc da artificial [50, 59-62]. Thông thường, fibroblasts được nuôi cấy trong một ma trận ngoại bào ba chiều, kết quả là một lớp hạ bì simplified có thể được sử dụng như là một nền tảng cho sự phát triển của một multilayered epi-lớp hạ bì bằng cách sử dụng keratinocytes. Như một hệ thống phức tạp, tương tác, các mô hình da đã được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ giữa ma trận extracellu-lar, fibroblast sự khác biệt [63] và vai trò mà fibroblasts có trong remodelling ma trận ngoại bào [64] và thúc đẩy tăng trưởng keratinocyte và sự khác biệt [65, 66]. Sự hiểu biết khả năng của tế bào-tế bào và tế bào-ma trận tương tác để điều chỉnh sự gia tăng tế bào và sự khác biệt sẽ thúc đẩy nghiên cứu chữa bệnh của vết thương và có một tác động đáng kể vào việc cải thiện phương pháp cũ-isting cho nền văn hóa trong ống nghiệm của tế bào da và thay thế các thiết kế.Năng lực cho các tế bào tạo máu tổ tiên để sinh sôi nảy nở và entiate khác nhau vào tất cả các dòng dõi tế bào máu cung cấp một phương tiện hấp dẫn để sản xuất các thành phần di động cần thiết để điều trị một loạt các ma-lignant và ác rối loạn. Như số hematopoi etic cho các tế bào được tìm thấy trong máu huy động ngoại vi máu, tủy xương hoặc dây rốn, tuyệt đối là thấp, đã có một quan tâm tích cực trong việc phát triển phương pháp trong ống nghiệm văn hóa có chọn lọc sẽ tăng specific tạo máu pro-genitors [18, 67]. Với identification và phát triển của cy-tokines tái tổ hợp mà có thể gây ra sự gia tăng và sự khác biệt của hematopoi- etic tế bào và khả năng để chọn lọc tách quần thể tổ tiên và trưởng thành tế bào của lãi suất, kiểm soát các điều kiện thử nghiệm cần thiết để mở rộng các tế bào tạo máu tổ tiên đã đạt được [68, 69]. Ví dụ, việc bổ sung các tế bào gốc yếu tố, phối tử phân bào Flt-3, throm-bopoietin và specific interleukins đã được sử dụng để tăng số lượng lâu dài văn hóa bắt đầu các tế bào máu dây rốn được sử dụng trong Iran tủy xương sau myeloablative có-apy [70-72]. Các ví dụ vivo mở rộng của các tế bào megakaryocytic đã ac-cách theo đuổi như một phương tiện để làm giảm nhu cầu về nhà tài trợ có nguồn gốc tiểu cầu được sử dụng trong điều trị giảm tiểu cầu [73, 74]. Tương tự, ex vivo mở rộng của tế bào cây trong khoáng vật trình bày kháng nguyên [75] và độc tế bào lym-phocytes [76] được khám phá do việc sử dụng tiềm năng của các tế bào cho immunotherapy. Khả năng bảo tồn các thuộc tính kiểu hình của một dân số tế bào tạo máu và thao tác sự khác biệt của các tế bào vào dòng dõi trưởng thành specific thể hiện sự tiến bộ significant đã được thực hiện trong việc thúc đẩy công nghệ trong ống nghiệm văn hóa.2.3Hạn chế của trong ống nghiệm văn hóaTrong khi trong ống nghiệm văn hóa đã được sử dụng có hiệu quả cho preserva-tion lâu dài của nhiều loại tế bào và các mô được sử dụng trong khoa học và công nghiệp, nó không phải là một chiến lược lý tưởng cho lớn -