).The PCR-DGGE analysis of bulk cel

).The PCR-DGGE analysis of bulk cells after cultivation can also support the analysis of the microbial diversity in food after direct DNA extraction. It can be useful to understand which species found in the DGGE profiles are cultivable and whether there is agreement or inconsistency between the results obtained by PCR-DGGE from direct DNA extraction and species detection after cultivation. For example, comparing DGGE profiles of mineral waters and fingerprints of the plated samples of the same waters, Dewettinck et al. (2001) established the percentage of noncultivable species in their bottled mineral water samples. Ro¨ling et al. (2001) used this approach to investigate the dynamics of the cultivable community during the manufacturing of vanilla beans from different batches. The authors could relate the number of bacteria counted on media to the diversity in number of species dominating every specific phase of the process. Moreover, the analysis of the bulk DGGE profiles allowed to observe the shifts of the cultivable community members following temperature treatments and to highlight the presence of unculturable species by comparing the same profiles with the DGGE fingerprints of the DNA directly extracted from the samples (Ro¨ling et al., 2001). Similarly, Ercolini et al. (2003a) realised that the Lactococcus species used as starter in Stilton cheese could not be isolated from the final product. In fact, the species was recovered as DGGE band in the Stilton profile but not from the bulk profile from the countable plates. Furthermore, Ercolini et al. (2001b) enlarged the number of species identified in NWCs for Mozzarella cheese production by sequencing DGGE bands from bulk profiles arising from specific media; this result may indicate that sometimes retrieving information on the microbial diversity only from DGGE profiles after a direct DNA extraction from a food sample cannot be enough, and that cultivation should be also considered. Analysis of DGGE profiles obtained from bulk cells provides an image of the cultivable community, while simultaneously allowing ecological information to be obtained. Ercolini et al. (2001b) counted in NWCs for Mozzarella cheese production a population of mesophilic streptococci of 108 cfu ml
1, but realised, after the bulk PCR-DGGE analysis of all the dilutions, that the only species reaching the value of 108 was the thermophilic S. thermophilus and that mesophilic cocci were only present at levels of 104 cfu ml
1. A novel application of this approach has been recently reported by Miambi et al. (2003). The PCRDGGE analysis was performed on DNA extracted from enriched cultures in appropriate liquid media used for most probable number (MPN) counts of samples of cassava dough. The analysis allowed to identify the dominant species occurring at the highest dilutions; moreover, it was possible to identify species that did not occur in the DGGE profiles arising from DNA directly extracted from the cassava samples. Miambi et al. (2003) could also evaluate the suitability of the culture media employed and concluded that none of the substrates could cover all the representative members of the bacterial community and that a series of selective media should be employed to count and isolate bacteria during cassava fermentation. This procedure can also investigate on the selectivity of some culture media. In some cases, in fact, it was shown that the selectivity of some culture media for LAB was not satisfactory (Ercolini et al., 2001b, 2003a).
7. Reference patterns: markers ‘‘made of species’’
An alternative to the sequencing of the DGGE bands to identify the microbial species occurring in a DGGE profile is constructing a molecular ladder using 16S rDNA amplicons of representative species of the food to analyse. The PCR product from the DNA template directly extracted from the food is run in a DGGE gel along with a mixture of the amplicons of the reference species as ladder. The identification of bacteria is then achieved by comparison of the PCR amplicon migration distances in DGGE gels with those of reference strains present in the identification ladder. Although this procedure is much easier than the sequencing of the bands, it does not absolutely guarantee an unequivocal identification due to some implicit drawbacks. Several authors report cases of comigration of amplicons from different species in the DGGE gel (Ercolini et al., 2001a, 2003a; van Beek and Priest, 2002; Meroth et al., 2003). This is because many species of bacteria are closely related and the 16S rDNA fragment analysed may not contain major differences allowing separation by DGGE.

Kết quả (Việt) 1:

). Đảng Cộng sản Romania-DGGE phân tích của số lượng lớn các tế bào sau khi trồng cũng có thể hỗ trợ phân tích sự đa dạng vi sinh vật trong thực phẩm sau khi trực tiếp DNA khai thác. Nó có thể hữu ích để hiểu những loài tìm thấy trong các cấu hình DGGE được cultivable và cho dù đó là thỏa thuận hoặc các mâu thuẫn giữa các kết quả thu được bởi Đảng Cộng sản Romania-DGGE từ trực tiếp DNA khai thác và loài phát hiện sau khi trồng. Ví dụ, so sánh dấu vân tay của mẫu nước tương tự, mạ và DGGE hồ sơ của nước khoáng, Dewettinck et al. (2001) thành lập tỷ lệ phần trăm của loài noncultivable trong mẫu nước khoáng đóng chai của họ. Ro¨Ling et al. (2001) sử dụng cách tiếp cận này để điều tra các động thái của cộng đồng cultivable trong sản xuất của vani đậu từ lô khác nhau. Các tác giả có thể liên quan số lượng vi khuẩn tính trên phương tiện truyền thông để sự đa dạng trong số lượng các loài thống trị mọi giai đoạn cụ thể của quá trình. Hơn nữa, các phân tích của các cấu hình DGGE số lượng lớn được cho phép để quan sát những thay đổi của các thành viên cộng đồng cultivable theo nhiệt độ phương pháp điều trị và để làm nổi bật sự hiện diện của unculturable loài bằng cách so sánh các cấu hình cùng với các dấu vân tay DGGE ADN trực tiếp được chiết xuất từ các mẫu (Ro¨ling và ctv., 2001). Tương tự, Ercolini et al. (2003a) nhận ra rằng các loài Lactococcus được sử dụng như là starter trong pho mát Stilton có thể không được phân lập từ sản phẩm cuối cùng. Trong thực tế, các loài được phục hồi như ban nhạc DGGE trong hồ sơ Stilton nhưng không phải từ hồ sơ với số lượng lớn từ các mảng đếm được. Hơn nữa, Ercolini et al. (2001b) mở rộng số lượng các loài được xác định trong NWCs Mozzarella phô mai sản xuất bởi xác định trình tự DGGE ban nhạc từ hồ sơ với số lượng lớn phát sinh từ phương tiện cụ thể; kết quả này có thể chỉ ra rằng đôi khi lấy thông tin về sự đa dạng vi khuẩn chỉ từ hồ sơ DGGE sau khi một khai thác ADN trực tiếp từ một mẫu thực phẩm không thể là gieo trồng đủ, và đó nên được coi là. Phân tích của cấu hình DGGE thu được từ số lượng lớn tế bào cung cấp một hình ảnh của cộng đồng cultivable, trong khi đồng thời cho phép sinh thái thông tin thu được. Ercolini et al. (2001b) được tính vào NWCs sản xuất pho mát Mozzarella dân số hay Streptococcus 108 cfu ml 1, nhưng nhận ra, sau khi số lượng lớn Đảng Cộng sản Romania-DGGE phân tích của tất cả các dilutions, mà là loài duy nhất đạt giá trị của 108 là thermophilus S. nhiệt và hay cocci được chỉ hiện diện ở các cấp độ của 104 cfu ml 1. Một ứng dụng mới lạ của cách tiếp cận này mới đã được báo cáo bởi Miambi et al. (2003). PCRDGGE phân tích được thực hiện trên DNA chiết xuất từ nền văn hóa phong phú trong truyền thông thích hợp chất lỏng được sử dụng để có thể đặt số (MPN) buôn lậu mẫu bột sắn. Phân tích có thể xác định các loài chi phối diễn ra tại dilutions cao nhất; hơn nữa, nó đã có thể để xác định các loài đó đã không xảy ra trong các cấu hình DGGE phát sinh từ ADN trực tiếp được chiết xuất từ các mẫu sắn. Miambi et al. (2003) cũng có thể đánh giá sự phù hợp của phương tiện truyền thông văn hóa làm việc và kết luận rằng không ai trong số các chất có thể bao gồm tất cả các thành viên đại diện của cộng đồng vi khuẩn và một loạt các phương tiện truyền thông chọn lọc nên được sử dụng để truy cập và cô lập vi khuẩn trong quá trình lên men sắn. Thủ tục này cũng có thể điều tra trên chọn lọc một số phương tiện truyền thông văn hóa. Trong một số trường hợp, trong thực tế, nó hiển thị rằng chọn lọc một số phương tiện truyền thông văn hóa cho phòng thí nghiệm đã không đạt yêu cầu (Ercolini et al., 2001b, 2003a).7. tham khảo mô hình: đánh dấu '' làm loài ''Một thay thế cho trình tự của các ban nhạc DGGE để xác định các loài vi khuẩn xảy ra trong một cấu hình DGGE đang xây dựng một cái thang phân tử bằng cách sử dụng 16 rDNA amplicons loài đại diện của các thực phẩm để phân tích. Sản phẩm Đảng Cộng sản Romania từ mẫu ADN trực tiếp được chiết xuất từ thực phẩm được chạy trong một gel DGGE cùng với một hỗn hợp của amplicons loài tham khảo như bậc thang. Nhận dạng của vi khuẩn sau đó là đạt được bằng cách so sánh các đảng Cộng sản Romania amplicon di chuyển khoảng cách trong DGGE gel với những tài liệu tham khảo chủng hiện diện trong các bậc thang nhận dạng. Mặc dù thủ tục này là dễ dàng hơn nhiều so với trình tự của các ban nhạc, nó không hoàn toàn đảm bảo một nhận dạng rõ ràng do một số nhược điểm tiềm ẩn. Một số tác giả báo cáo trường hợp của comigration của amplicons từ loài khác nhau trong các gel DGGE (Ercolini et al., 2001a, 2003a; van Beek và linh mục, 2002; Meroth et al., 2003). Điều này là do nhiều loài vi khuẩn có liên quan chặt chẽ và 16 rDNA đoạn phân tích có thể không có sự khác biệt lớn cho phép tách bởi DGGE.