Western blot analysis. HT-29 cells

Western blot analysis. HT-29 cells (2x105) were seeded into
6-well plates in 2 ml medium and treated with various con-



centrations of EEHDW for 24 h. The treated cells were lysed with mammalian cell lysis buffer (M-PER; Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) containing protease and phosphatase inhibitor cocktails (EMD Biosciences and Sigma Chemical, USA, respectively), and the lysates were separated by Nusep
12% LongLife Tris Glycine iGels (Nusep Ltd., Australia) under a reducing condition using 200 V for 1 h. The proteins were then electrophoretically transferred onto nitrocellulose membranes using the iBlot Western detection stack/iBlot dry blotting system (Invitrogen). Membranes were blocked for 30 min with agitation at RT in SuperBlock T20 (TBS) blocking buffer (Thermo Scientific, Rockford, IL). Membranes were washed in TBS with 0.25% Tween-20 (TBST) and exposed to primary antibodies against Bcl-2 or Bax (1:1000, Cell Signaling Technology) overnight at 4˚C with rocking. ß-actin (1:1000, Cell Signaling Technology) was also measured as an internal control for protein loading. After membranes were washed in TBST, secondary horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibodies (anti-rabbit, Cell Signaling Technology) were added at 1:2500 dilution for 1 h at room temperature and the membranes were washed again in TBST. Blots were developed using Super Signal Pico Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), and images were taken using a Kodak image station 400R (Kodak, Rochester, NY, USA).

Kết quả (Việt) 1:

Phân tích phương Tây blot. HT-29 tế bào (2 x 105) được hạt vào6-cũng tấm ở 2 ml trung bình và được điều trị với các con- centrations của EEHDW cho 24 h. Các tế bào được điều trị được phân với các tế bào động vật có vú lysis đệm (M-một; Khoa học nhiệt, Rockford, IL, Hoa Kỳ) có món cocktail chất ức chế protease và phosphatase (EMD Biosciences và Sigma hóa chất, Hoa Kỳ, tương ứng), và các lysates đã được tách ra bởi Nusep12% LongLife Tris Glycine iGels (Nusep Ltd, Úc) theo một tình trạng giảm sử dụng 200 V cho 1 h. Các protein electrophoretically sau đó đã được chuyển giao vào nitrocellulose màng tế bào bằng cách sử dụng iBlot phương Tây phát hiện ngăn xếp/iBlot khô thấm hệ thống (Invitrogen). Màng bị chặn trong 30 phút với kích động lúc RT trong bộ đệm chặn SuperBlock T20 (TBS) (khoa học nhiệt, Rockford, IL). Màng đã được rửa sạch trong TBS với 0,25% Tween-20 (TBST) và tiếp xúc với chính kháng thể chống lại họ protein Bcl-2 hoặc Bax (1:1000, công nghệ tế bào tín hiệu) qua đêm tại 4˚C với rocking. ß-actin (1:1000, tế bào tín hiệu công nghệ) cũng được đo bằng một kiểm soát nội bộ cho protein tải. Sau khi màng tế bào đã được rửa sạch trong TBST, Trung học cải ngựa peroxidase (HRP)-kháng thể ngoại (chống thỏ, tế bào tín hiệu công nghệ) đã được thêm vào ở 1:2500 pha loãng cho 1 h ở nhiệt độ phòng và các màng đã được rửa sạch một lần nữa trong TBST. Blots được phát triển bằng cách sử dụng Super tín hiệu Pico bề mặt (khoa học nhiệt, Rockford, IL, Hoa Kỳ), và hình ảnh được chụp bằng cách sử dụng một hình ảnh Kodak trạm 400R (Kodak, Rochester, NY, Hoa Kỳ).

Kết quả (Việt) 2:

Phân tích Western blot. HT-29 tế bào (2x105) đã được gieo vào
tấm 6-tốt trong môi 2 ml và điều trị với con- khác nhau centrations của EEHDW trong 24 h. Các tế bào được xử lý được ly giải với động vật có vú di lysis buffer (M-PER; Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) có chứa protease và phosphatase cocktail inhibitor (EMD Biosciences và Sigma Chemical, USA, tương ứng), và các lysates được ngăn cách bởi Nusep 12 % Longlife Tris Glycine iGels (Nusep Ltd, Australia) theo một điều kiện giảm sử dụng 200 V cho 1 h. Các protein này sau đó được chuyển lên electrophoretically màng nitrocellulose sử dụng iBlot phương Tây phát hiện chồng / iBlot hệ thống thấm khô (Invitrogen). Màng được chặn trong 30 phút với cổ động tại RT trong superblock T20 (TBS) chặn đệm (Thermo Scientific, Rockford, IL). Màng được rửa trong TBS với 0,25% Tween-20 (TBST) và tiếp xúc với các kháng thể chống lại chính Bcl-2 hoặc Bax (1: 1000, Cell Signaling Technology) nghỉ đêm tại 4C với xích đu. ß-actin (1: 1000, Cell Signaling Công nghệ) cũng đã được đo như là một kiểm soát nội bộ để nạp protein. Sau khi màng được rửa trong TBST, peroxidase cải ngựa thứ cấp (HRP) -conjugated kháng thể (anti-thỏ, Cell Signaling Công nghệ) đã được thêm vào lúc 1: 2500 pha loãng trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng và các màng được rửa sạch một lần nữa trong TBST. Blots được phát triển bằng cách sử dụng siêu hiệu Pico Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), và hình ảnh được chụp bằng cách sử dụng một hình ảnh Kodak trạm 400R (Kodak, Rochester, NY, USA).