Materials and MethodsSample prepara

Materials and Methods
Sample preparation and DNA extraction
Authentic muscle samples of beef, pork and chicken were obtained from the traditional market in Yogyakarta, Indonesia. Meatball was prepared in laboratory scale with separate equipment to prevent cross contamination. Meatball samples were prepared by mixing pork with beef or chicken at a final concentration of pork at 0; 1.0; 2.5; 5.0; 10.0 and 25.0 % (w/w).
DNA was extracted from meatball samples using the High Pure PCR Template protocol for animal tissue provided with the High Pure PCR Template Kit (Roche, Germany). Approximately 50-100 mg of meatballs was blended using a commercial blender and placed in a 1,5 ml microcentrifuge tube. A-100 μl of tissue buffer and 40 μl Proteinase K were added and mixed by vortexing. The mixture was incubated at 55°C in a water bath overnight to disperse the sample until the tissue was completely lysed. The samples were then added with 200 μl binding buffer and incubated at 70°C for 10 min. The mixture was mixed b vortexing for seconds, added with 100 μl isopropanol, mixed vigorously and placed high filter tubes. The samples was subsequently poured in the collection tube, placed in table top centrifuge, and spun at 8,000 g for 1 min. The flow-through and collection tube were discarded and the High Filter Tube was placed in a new 2 ml collection tube. A-500 μl of wash buffer was added and spun at 8,000 g for 1 min. The flow-through and collection tube were discarded and the High Filter Tube was placed in another 2 ml collection tube. The high filter tube was dried by centrifugation for 10 seconds, and the supernatant flow-through was discarded. The High Filter Tube was placed in a clean 1.5 ml micro centrifuge tube. A-200 μl of pre-warmed elution buffer was added and spun at 8,000 g for 1 min to elute. The DNA solution was stored at 4 °C.
PCR amplification of a conserved Cytochrome 2b of Mitochondrial gene fragment
The set of primers used for amplification consisted of Cyt b-FW and Cyt b-REV oligonucleotides as follows: CYT b FW 5’-CCA TCC AAC ATC TCA GCA TGA TGA AA-3’, CYTb REV 5’-GCC CCT CAG AAT GAT ATT TGT CCT CA-3’. Amplification of the mt cyt b gene was performed in a final volume of 25 μl containing 250 ng of extracted DNA, mega-mix royal (optimized mixture of Taq polymerase, anti-Taq polymerase monoclonal antibodies in 2 X reaction buffer (6 mM MgCl2 with 400 μM dNTPs, stabilizer and blue loading dye) (Microzone Ltd, West Sussex, UK), and 20 pmol of each primer. Amplification was performed with a thermal cycler according to the following PCR step-cycle program: pre-denaturation of 94°C for 2 min to completely denature the DNA template, followed by 35 cycles of denaturation at 95°C for 36 s, annealing at 51°C for 73 s, and extension at 72°C for 84 s. Final extension at 72°C for 3 min followed the final cycle for complete synthesis of elongated DNA molecules. Two microlitres of PCR products were electrophoresed at constant voltage (50V) on 2% agarose gel (Promega, Madison, USA) for about an hour in 1x TBE buffer, pH 8.0 and stained by ethidium bromide. A-100 bp DNA ladder (Promega, Madison, USA) was used as size reference. The gel photo was taken using the Syngene gel documentation system.
Restriction fragment length polymorphism
Two units/μl of RE BseDI (Fermentas) were applied to 10 μl of amplified DNA in a final volume of 20 μl digestion mixture [containing 1x reaction buffer (10 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,2 mg/ml BSA, 1 mM DTT and 50% glycerol)] and were incubated at 55°C for 3 h for optimal result. A-5 μl of the digested samples were electrophoresed at constant voltage (50 V) on 2% agarose gel (Promega, Madison, USA) for about an hour in 1x TBE buffer, pH 8.0 and stained by ethidium bromide. A-100 bp (Promega, Madison, USA) was used as size reference. The gel photo was taken using the Syngene gel documentation system.

Kết quả (Việt) 1:

Vật liệu và phương phápChuẩn bị mẫu và khai thác DNA Xác thực cơ mẫu của thịt bò, thịt lợn và thịt gà đã thu được từ thị trường truyền thống ở Yogyakarta, Indonesia. Thịt viên được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm quy mô với các thiết bị riêng biệt để ngăn ngừa ô nhiễm chéo. Thịt viên mẫu đã được chuẩn bị bằng cách trộn thịt lợn với thịt bò hoặc thịt gà tại nồng độ cuối cùng của thịt lợn tại 0; 1,0; 2.5; 5.0; 10,0 và 25,0% (w/w).DNA được chiết xuất từ thịt viên mẫu bằng cách sử dụng giao thức cao tinh khiết PCR mẫu cho động vật mô cung cấp cho các cao nguyên chất PCR mẫu Kit (Roche, Đức). Khoảng 50-100 mg của thịt viên được pha trộn bằng cách sử dụng một máy xay sinh tố thương mại và đặt trong một ống microcentrifuge 1,5 ml. A-100 μl mô đệm và 40 μl Proteinase K đã được thêm vào và phối khí bởi vortexing. Hỗn hợp được ủ tại 55° C trong một bồn tắm nước qua đêm để phân tán mẫu cho đến khi các tế bào hoàn toàn phân. Các mẫu sau đó được bổ sung với 200 μl ràng buộc đệm và ủ tại 70° C trong 10 phút. Hỗn hợp hỗn hợp b vortexing giây, được bổ sung với 100 μl isopropanol, hỗn hợp mạnh mẽ và đặt bộ lọc cao ống. Các mẫu sau đó được đổ vào ống bộ sưu tập, đặt trong bảng trên cùng máy ly tâm, và tách 8.000 g cho 1 phút. Dòng chảy qua và bộ sưu tập ống đã được loại bỏ và ống lọc cao được đặt trong một ống 2 ml bộ sưu tập mới. A-500 μl rửa đệm được thêm vào và tách 8.000 g cho 1 phút. Dòng chảy qua và bộ sưu tập ống đã được loại bỏ và bộ lọc ống cao được đặt trong một 2 ml bộ sưu tập ống. Bộ lọc cao ống được sấy khô bằng số trong 10 giây, và supernatant dòng chảy qua đã được loại bỏ. Bộ lọc ống cao đã được đặt trong một ống máy ly tâm vi sạch 1.5 ml. A-200 μl pre-ấm elution đệm được thêm vào và tách 8.000 g cho 1 phút để elute. Giải pháp DNA đã được lưu trữ ở 4 ° C.Đảng Cộng sản Romania khuếch đại của một 2b Cytochrome bảo tồn của gen ti thể mảnh Bao gồm các thiết lập của chất nền, mồi được sử dụng cho khuếch đại của Cyt b-FW và Cyt b-REV oligonucleotides như sau: CYT b FW 5'-CCA TCC AAC ATC TCA GCA TGA TGA AA-3', CYTb REV 5'-GCC CCT CAG AAT GAT ATT TGT CCT CA-3'. Các khuếch đại của mt cyt b gen đã được thực hiện trong một tập cuối cùng của 25 μl có 250 ng chiết xuất DNA, mega-mix royal (tối ưu hóa các hỗn hợp của Taq polymerase, chống-Taq polymerase monoclonal kháng thể trong 2 X phản ứng đệm (6 mM MgCl2 với 400 μM dNTPs, ổn định và xanh tải thuốc nhuộm) (Microzone Ltd, West Sussex, Vương Quốc Anh), và 20 pmol của mỗi mồi. Khuếch đại được thực hiện với một người đạp xe máy nhiệt theo chương trình sau bước-chu kỳ Đảng Cộng sản Romania: Pre-denaturation 94° C cho 2 phút để hoàn toàn denature các mẫu DNA, tiếp nối bởi 35 chu kỳ của denaturation tại 95° C cho 36 s, làm cho deo lúc 51° C cho 73 s, và phần mở rộng ở 72° C cho 84 s. phần mở rộng cuối cùng tại 72° C cho 3 phút theo chu kỳ cuối cùng cho các tổng hợp đầy đủ của các phân tử DNA thuôn dài. Hai microlitres của Đảng Cộng sản Romania sản phẩm đã được electrophoresed tại điện áp không đổi (50V) trên 2% agarose gel (Promega, Madison, Mỹ) cho khoảng một giờ trong 1 x TBE đệm, pH 8,0 và màu bởi ethidium bromua. A-100 bp bậc thang DNA (Promega, Madison, Mỹ) được sử dụng làm tham chiếu kích thước. Gel ảnh được thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống tài liệu gel Syngene.Hạn chế mảnh chiều dài đa hìnhHai đơn vị/μl của RE BseDI (Fermentas) đã được áp dụng cho 10 μl khuếch đại DNA trong một tập cuối cùng của hỗn hợp tiêu hóa 20 μl [có 1 x phản ứng đệm (10 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,2 mg/ml BSA, 1 mM DTT và 50% glycerol)] và đã được ủ tại 55° C cho 3 h cho kết quả tối ưu. A-5 μl mẫu tiêu hóa được electrophoresed tại áp (50 V) trên 2% agarose gel (Promega, Madison, Mỹ) cho khoảng một giờ trong 1 x TBE đệm, pH 8,0 và màu bởi ethidium bromua. A-100 bp (Promega, Madison, Mỹ) được sử dụng làm tham chiếu kích thước. Gel ảnh được thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống tài liệu gel Syngene.

Kết quả (Việt) 2:

Vật liệu và phương pháp
chuẩn bị mẫu và chiết DNA
mẫu cơ Authentic thịt bò, thịt lợn và thịt gà được lấy từ các thị trường truyền thống ở Yogyakarta, Indonesia. Meatball đã được chuẩn bị ở quy mô phòng thí nghiệm với các thiết bị riêng biệt để ngăn ngừa lây nhiễm chéo. Mẫu thịt viên đã được chuẩn bị bằng cách trộn thịt lợn với thịt bò hoặc thịt gà ở một nồng độ cuối cùng của thịt heo tại 0; 1,0; 2,5; 5,0; 10.0 và 25.0% (w / w).
DNA được chiết xuất từ các mẫu thịt viên sử dụng các giao thức cao tinh khiết PCR Template cho các mô động vật được cung cấp với các cao nguyên chất Template PCR Kit (Roche, Đức). Khoảng 50-100 mg thịt viên đã được pha trộn bằng máy xay sinh tố thương mại và được đặt trong một ống microcentrifuge 1,5 ml. A-100 ml đệm mô và 40 ml proteinase K đã được thêm vào và trộn bởi vortexing. Hỗn hợp được ủ ở 55 ° C trong một cốc nước qua đêm để giải tán mẫu cho đến khi các mô đã hoàn toàn bị ly giải. Các mẫu sau đó thêm 200 ml ràng buộc đệm và ủ ở 70 ° C trong 10 phút. Hỗn hợp này được pha trộn b vortexing cho giây, thêm 100 ml isopropanol, trộn mạnh mẽ và đặt ống lọc cao. Các mẫu sau đó đã được đổ vào các ống thu, được đặt trong bảng máy ly tâm hàng đầu, và kéo dài 8.000 g trong 1 phút. Dòng chảy qua và bộ sưu tập ống đã được loại bỏ và các Bộ lọc ống cao đã được đặt trong một ống 2 ml sưu tập mới. A-500 ml rửa đệm được thêm vào và quay 8.000 g trong 1 phút. Dòng chảy qua và bộ sưu tập ống đã được loại bỏ và các Bộ lọc ống cao đã được đặt trong một ống thu 2 ml. Các ống lọc cao đã được sấy khô bằng ly tâm trong 10 giây, và nổi trên mặt dòng chảy qua đã được bỏ đi. Lọc ống cao được đặt trong một ống ly tâm 1,5 ml vi sạch. A-200 ml pre-ấm rửa giải đệm được thêm vào và quay 8.000 g trong 1 phút để rửa giải. . Các giải pháp DNA được lưu trữ ở 4 ° C
khuếch đại PCR của một bảo Cytochrome 2b của ti thể gene mảnh
Tập hợp các đoạn mồi được sử dụng để khuếch đại gồm cyt b-FW và cyt oligonucleotide b-REV như sau: cyt b FW 5'-CCA TCC AAC ATC TCA GCA TGA TGA AA-3 ', 5'-REV CYTb GCC CCT CAG AAT GAT ATT TGT CCT CA-3'. Khuếch đại các gen b mt cyt được thực hiện trong một thể tích cuối cùng của 25 ml chứa 250 ng DNA chiết xuất, mega-mix hoàng gia (hỗn hợp tối ưu của Taq polymerase, chống Taq polymerase kháng thể đơn dòng trong 2 X phản ứng đệm (6 mM MgCl2 với 400 mM dNTP, chất ổn định và chất nhuộm màu xanh tải) (Microzone Ltd, West Sussex, Anh), và 20 pmol của mỗi mồi khuếch đại được thực hiện với một chu trình nhiệt theo các bước chương trình chu kỳ PCR sau đây:. trước sự biến tính của 94 ° C trong 2 phút để hoàn toàn làm biến tính các mẫu DNA, tiếp theo là 35 chu kỳ của sự biến tính ở 95 ° C trong 36 s, ủ ở 51 ° C trong 73 s, và mở rộng ở 72 ° C trong 84 s. mở rộng cuối cùng ở 72 ° C 3 phút sau chu kỳ thức để tổng hợp đầy đủ các phân tử ADN dài. Hai microlitres của sản phẩm PCR được electrophoresed ở điện áp không đổi (50V) trên 2% agarose gel (Promega, Madison, Mỹ) trong khoảng một giờ đồng hồ trong 1x TBE đệm, pH 8.0 và nhuộm màu bằng ethidium bromide. A-100 bp thang DNA (Promega, Madison, Mỹ) đã được sử dụng làm tài liệu tham khảo kích thước. Những hình ảnh gel được chụp hệ thống tài liệu gel Syngene.
Restriction fragment length polymorphism
Hai đơn vị / ml RE BseDI (Fermentas) được áp dụng cho 10 ml DNA khuếch đại trong một khối lượng cuối cùng của 20 ml hỗn hợp tiêu hóa [bao gồm 1x phản ứng đệm (10 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,2 mg / ml BSA, 1 mM DTT và 50% glycerol)] và được ủ ở 55 ° C trong 3 giờ cho kết quả tối ưu. A-5 ml mẫu tiêu hóa được electrophoresed ở điện áp không đổi (50 V) trên 2% agarose gel (Promega, Madison, Mỹ) trong khoảng một giờ đồng hồ trong 1x TBE đệm, pH 8.0 và nhuộm bằng ethidium bromide. A-100 bp (Promega, Madison, Mỹ) đã được sử dụng làm tài liệu tham khảo kích thước. Những hình ảnh gel được chụp hệ thống tài liệu gel Syngene.