prow Hi:Oaring by Microbial Cell Su

prow Hi:Oaring by Microbial Cell Surface Doplay
2,2 Functional Screening of Cell-Surface-Exposed Enzyme Libraries
2,2.1 Direct Positive Selection
Direct methods for screening or selection link improved enzyme activity to colony phenotypes or to the survival or growth rates of cells, respectively. Examples of this method include colony screening on plates using chrome-genic genic substrates (56), selection on plates containing increasing antibiotic concentrations (2), and complementation selection with auxotrophs 157).
However, intracellular expression of the enzyme of interest requires that it does not negatively interlere with cellular metabolism, that the enzymatic activity can be distinguished from the background of all other cell reactions, and That an externally added substrate readily enters the cytoplasm of the enzyme producing cell. This restriction can be overcome by displaying the protein of interest on the surface of the microbial cell, Recently, the ice nucleation protein (INP)-based bacterial surface display system has been used to selectively screen enzyme libraries for improved catalytic activity of carboxymethyl ccllulase (CMCase) (28). The substrate of this enzyme, carboxymethyl cellulose (CMC), is a high-molecular-weight polymer, which is not transported into cells. As a result, only cells displaying CMCase on their surface are able to hydrolyze CMC in agar plates and can easily be identified because they are surrounded by a clear halo after Congo red staining. Furthermore, growth rates of E. con cells displaying CMCase variants on minimal medium containing CMC as the sole carbon source were found to be correlated with the activities of displayed CMCase variants. i
As a conse-quence, by selecting rapidly growing colonies, cells containing improved CMCase variants with fivefold increased activity could be isolated (28).
2.2.2 Screening of Microbial Populations by Flow Cytometry
One major advantage of microbial surface display over other display formats lies in the ability to use fluorescence-activated cell sorting (FACS) for very high throughput screening of polypeptide libraries. As more powerful combinatorial mutagencsis methods are now available, designing screening strategies becomes the most critical step in the successful exploitation of molecular diversity. In this respect, flow cytometry has been established over the recent years as a powerful tool for the screening of microbial populations for elevated gene expression, enhanced catalytic performance, or improved binding capabilities, as detailed in the following sections.
To isolate proteins with enhanced binding capabilities to a particular ligand, the library of cells, where each cell individually displays numerous copies of a unique protein variant, is incubated with a fluorescently labeled ligand. After thorough washing, only cells displaying a protein variant with

Kết quả (Việt) 1:

mũi Hi: mái chèo bằng vi sinh vật tế bào bề mặt Doplay2,2 chức năng kiểm tra các thư viện di động-bề mặt tiếp xúc Enzyme2,2.1 lựa chọn trực tiếp tích cựcCác phương pháp trực tiếp để kiểm tra hoặc lựa chọn liên kết hoạt động của enzyme cải tiến đến thuộc địa phenotypes hoặc tỷ lệ sống sót hoặc tăng trưởng của các tế bào, tương ứng. Ví dụ về phương pháp này bao gồm các thuộc địa kiểm tra trên các tấm bằng khuyếch chrome khuyếch chất (56), các lựa chọn trên đĩa có chứa tăng nồng độ kháng sinh (2) và lựa chọn complementation với auxotrophs 157).Tuy nhiên, các biểu hiện nội bào của enzyme quan đòi hỏi rằng nó không tiêu cực không interlere với sự trao đổi chất của tế bào, các hoạt động enzym có thể phân biệt từ nền tảng của tất cả các phản ứng di động khác, và một bề mặt bên ngoài nhập dễ dàng vào tế bào chất của enzym sản xuất các tế bào. Hạn chế này có thể được khắc phục bằng cách hiển thị các protein lãi suất trên bề mặt tế bào vi khuẩn, gần đây, băng nucleation protein (INP)-hệ thống dựa trên Hiển thị do vi khuẩn trên bề mặt đã được sử dụng để chọn lọc trên màn hình thư viện enzym để cải thiện chất xúc tác hoạt động của carboxymethyl ccllulase (CMCase) (28). Bề mặt của enzyme này, carboxymethyl cellulose (CMC), là một polymer cao trọng phân tử không được vận chuyển vào tế bào. Do đó, chỉ hiển thị CMCase trên bề mặt của tế bào có thể hydrolyze CMC tại agar tấm và có thể dễ dàng được xác định bởi vì họ được bao quanh bởi một quầng rõ ràng sau khi nhuộm màu đỏ Congo. Hơn nữa, tốc độ tăng trưởng của E. con Hiển thị các biến thể CMCase trên tối thiểu CMC vừa chứa như là nguồn gốc duy nhất carbon đã được tìm thấy được tương quan với các hoạt động của các biến thể CMCase Hiển thị các tế bào. tôiNhư là một conse-quence, bằng cách chọn ngày càng tăng nhanh thuộc địa, các tế bào có chứa các phiên bản CMCase cải tiến với các hoạt động tăng gấp năm lần có thể là cô lập (28).2.2.2 kiểm tra của các quần thể vi sinh vật của dòng chảy CytometryMột lợi thế lớn của vi khuẩn trên bề mặt màn hình trên màn hình hiển thị các định dạng khác nằm trong khả năng sử dụng huỳnh quang kích hoạt tế bào phân loại (FACS) xét nghiệm tầm soát rất cao thông qua các thư viện polypeptide. Như mạnh mẽ hơn các phương pháp tổ hợp mutagencsis bây giờ có sẵn, thiết kế kiểm tra chiến lược trở thành bước quan trọng nhất trong việc khai thác thành công của phân tử đa dạng. Trong sự tôn trọng này, dòng cytometry đã được thành lập trong những năm gần đây như một công cụ mạnh mẽ cho việc kiểm tra của các quần thể vi sinh vật để biểu hiện gen tăng cao, tăng cường hiệu suất chất xúc tác, hoặc khả năng ràng buộc được cải thiện, chi tiết trong các phần sau.Để cô lập các protein với khả năng tăng cường liên kết đến một phối tử cụ thể, các thư viện của các tế bào, nơi mà mỗi tế bào cá nhân Hiển thị nhiều bản sao của một phiên bản duy nhất protein, ủ với một phối tử fluorescently có nhãn. Sau khi rửa kỹ lưỡng, chỉ các tế bào Hiển thị một phiên bản protein với

Kết quả (Việt) 2:

mũi Hi: xuồng bởi vi sinh vật bề mặt di Doplay
2,2 chức năng Chiếu Cell-bề mặt xúc Enzyme Libraries
2,2.1 lựa chọn trực tiếp dương
phương pháp trực tiếp để kiểm tra hoặc lựa chọn liên kết cải thiện hoạt động của enzyme để kiểu hình thuộc địa hoặc cho sự tồn tại, phát triển, tỷ lệ tế bào , tương ứng. Ví dụ về các phương pháp này bao gồm sàng lọc thuộc địa trên tấm bằng chất genic chrome-genic (56), lựa chọn trên đĩa có chứa nồng độ kháng sinh ngày càng tăng (2), và lựa chọn bổ với auxotrophs 157).
Tuy nhiên, biểu hiện trong tế bào của các enzyme quan tâm đòi hỏi nó không interlere tiêu cực với sự trao đổi chất của tế bào, mà các hoạt động của enzyme có thể được phân biệt với các nền tảng của tất cả các phản ứng tế bào khác, và đó là một chất nền bên ngoài thêm dễ dàng xâm nhập vào tế bào chất của sản xuất enzyme tế bào. Hạn chế này có thể được khắc phục bằng cách hiển thị các protein của lãi suất trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, Gần đây, các protein băng mầm (INP) dựa trên vi khuẩn hệ thống hiển thị bề mặt đã được sử dụng cho các thư viện enzyme có chọn lọc màn hình để cải thiện hoạt động xúc tác của carboxymethyl ccllulase ( CMCase) (28). Các chất nền của enzyme này, carboxymethyl cellulose (CMC), là một polymer trọng lượng phân tử cao, mà không được vận chuyển vào tế bào. Kết quả là, chỉ có các tế bào hiển thị CMCase trên bề mặt của chúng có khả năng thủy phân CMC trong đĩa thạch và có thể dễ dàng được xác định bởi vì họ được bao quanh bởi một quầng sáng rõ ràng sau khi Congo nhuộm đỏ. Hơn nữa, tốc độ tăng trưởng của các tế bào con E. hiển thị CMCase biến thể trên môi trường tối thiểu có chứa CMC như nguồn carbon duy nhất được tìm thấy có mối tương quan với các hoạt động của các biến thể CMCase hiển thị. i
Là một conse-quence, bằng cách lựa chọn nhanh chóng phát triển các thuộc địa, các tế bào có chứa cải thiện CMCase biến thể với tăng gấp năm lần hoạt động có thể được cô lập (28).
2.2.2 Chiếu Microbial quần bởi dòng Cytometry
Một lợi thế lớn của màn hình bề mặt của vi sinh vật trên các định dạng hiển thị khác nằm trong khả năng sử dụng huỳnh quang kích hoạt phân loại tế bào (FACS) để sàng lọc thông lượng rất cao của các thư viện polypeptide. Như mạnh hơn các phương pháp mutagencsis tổ hợp đang có sẵn, thiết kế chiến lược sàng lọc trở thành bước quan trọng nhất trong việc khai thác thành công của sự đa dạng phân tử. Ở khía cạnh này, luồng đếm tế bào đã được thành lập trong những năm gần đây là một công cụ mạnh mẽ cho việc kiểm tra của các quần thể vi sinh vật biểu hiện gen cao, nâng cao hiệu suất xúc tác, hoặc cải thiện khả năng ràng buộc, như chi tiết trong các phần sau.
Để phân lập protein có ràng buộc tăng cường khả năng để một phối tử đặc biệt, các thư viện của các tế bào, nơi từng ô riêng biệt hiển thị nhiều bản sao của một biến thể protein độc đáo, được ủ với một phối tử huỳnh quang dán nhãn. Sau khi rửa kỹ lưỡng, chỉ có các tế bào hiển thị một biến thể protein với