Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ trên có hiệu lực aminopeptidase activity.The của pH đến hoạt động aminopeptidase đã được xác định trong khoảng từ pH 3,5-8,5 bằng cách sử dụng các bộ đệm sau: 50 mM citric acid NaOH, pH 3,5-5,5; 50 mM sodium acetate, pH 4,0-5,5; 50 mM sodium phosphate, pH 6,0-7,0; và Tris-HCl, pH 7,5-8,5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đã được xác định tại pH tối ưu trong khoảng 6-40 ° C, bằng cách thích ứng với thời gian ủ đến sự ổn định của enzyme ở mỗi nhiệt độ, như được mô tả (22) trước đó. Trong mọi trường hợp, hoạt động được thể hiện như là một tỷ lệ phần trăm của hoạt động thu được tại một trong hai pH tối ưu hoặc nhiệt độ tối ưu. Ảnh hưởng của tác nhân hóa học và các cation kim loại trên tác dụng aminopeptidase activity.The các chất ức chế tiềm năng hoặc kích hoạt trên hoạt động aminopeptidase arginine đã được xác định bằng cách một số tác nhân hóa học và muối kim loại, ở mức 0,1 hoặc 1 mM, vào bộ đệm phản ứng. Hoạt động này được khảo nghiệm như mô tả ở trên và thể hiện như một tỷ lệ phần trăm của hoạt động này đạt được trong sự vắng mặt của các hợp chất bổ sung. hoạt động tương đối Substrate specificity.The của aminopeptidase arginine đối với một số chất huỳnh quang được xác định bằng xét nghiệm hoạt động tiêu chuẩn. Tỷ lệ tương đối của quá trình thủy phân của một số aminoacyl-p-nitroanilide (PNA) chất cũng đã được xác định. Hỗn hợp phản ứng gồm 250 ml 50 mM citric acid NaOH (pH 5.0) có chứa 0,5 mM chất nền và 50 ml enzyme. Hấp thụ ở 415 nm được xác định trong một đầu đọc multiplate (Ultramark Mẫu 550; Bio-Rad) sau 30 phút ủ. Hoạt động tương đối so với dipeptides khác nhau đã được khảo nghiệm bằng cách theo dõi sự biến mất của mình bằng hiệu suất cao sắc ký lỏng (HPLC) sử dụng hệ thống Hewlett-Packard HPLC 1050 (Waters Tổng công ty, Milford, Mass). Hỗn hợp phản ứng gồm 100 ml 50 mM citric acid NaOH (pH 5,0), 25 ml 10 mM peptide, và 25 ml enzyme. Hỗn hợp này được ủ ở 37 ° C cho đến khi 60 phút, và phản ứng đã được ngừng lại bằng cách thêm 25 ml 30% axit axetic. Mẫu (20 ml) đã được nạp vào một cột Spherisorb SCX (25 0,46 cm; Teknokroma, Barcelona, Tây Ban Nha). Tách được thực hiện bằng cách sử dụng một clorua natri dốc giữa hai dung môi: 20% (vol / vol) acetonitrile trong 6 mM HCl (dung môi A) và 20% (vol / vol) acetonitrile trong 6 mM HCl có chứa 1 M NaCl (dung môi B ). Peptide được tách rửa trong một gradient tuyến tính 0-55% dung môi B trong 8 phút với tốc độ dòng chảy 1,2 ml · min-1 ở 40 ° C. Phát hiện được thực hiện tại 214 nm bằng cách sử dụng một máy dò tia cực tím bước sóng biến. Tất cả dipeptides, chất fluorogenic, và nhiều chất sinh màu được lấy từ Sigma. Xác định các thông số parameters.Kinetic động của enzyme tinh khiết đã được ước tính cho Arg-AMC và Lys-AMC bằng cách sử dụng nồng độ khác nhau, 0,005-0,1 mM. Hoạt động này được đo liên tục ở 37 ° C như mô tả ở trên. Thông số động học đã được tính từ Lineweaver-Burk lô. Trước mục Tiếp theo mục Kết quả lọc của enzyme.An arginine aminopeptidase của L. sakei được tinh chế bằng phân đoạn chọn lọc với ammonium sulfate và ba bước sắc ký. Các kết quả của từng bước thanh lọc được thể hiện trong Bảng 1 và Hình. 1. Các hoạt động thủy phân Arg-AMC tách rửa từ cột phenyl-Sepharose như một đỉnh cao duy nhất tại 0,16-0,14 M (NH4) 2SO4. Hoạt động này một phần coeluted với các hoạt động thủy phân Leu-AMC (Hình 1). Bước sắc ký trên cột lọc gel cho phép sự tách biệt hoàn toàn của các hoạt động aminopeptidase chất gây ô nhiễm (thể tích rửa giải, 84 ml) từ hoạt động Arg-AMC thủy phân (thể tích rửa giải, 60 ml) (Hình 1 B). Các hoạt động thủy phân Arg-AMC tách rửa từ cột tài nguyên Q là hai đỉnh riêng biệt: một phần nhỏ ở 0,22 M NaCl và một phần lớn ở mức 0,29 M NaCl (Hình 1 C). Các phân số tương ứng với đỉnh cao thứ hai cho thấy một băng protein duy nhất khi phân tích bằng SDS-PAGE (Hình 2). Toàn bộ thủ tục dẫn đến một hiệu suất thu hồi là 4,2% và tăng 500 lần trong tính đặc hiệu. FIG. . 1 Xem phiên bản lớn hơn: Trong trang này trong một cửa sổ mới Download như PowerPoint Slide FIG. 1. sắc ký từ các bước khác nhau trong thanh lọc L. sakei aminopeptidase arginine. Protein đã được phát hiện bằng cách đo độ hấp thụ ở 280 nm (dòng rắn); hoạt động aminopeptidase đã được khảo nghiệm đối với Arg-AMC, ở pH 5.0 (vòng tròn rắn), và Leu-AMC, ở pH 7.5 (hình vuông rắn) (xem Vật liệu và phương pháp để biết chi tiết) và thể hiện các đơn vị huỳnh quang (FU). (A) Phenyl-Sepharose sắc ký với (NH4) 2SO4 gradient (ánh sáng chấm line); (B) Sephacryl 200 sắc ký nhân sự; (C) Resource Q sắc ký với NaCl gradient (ánh sáng đường chấm). FIG. . 2 Xem phiên bản lớn hơn: Trong trang này trong một cửa sổ mới Download như PowerPoint Slide FIG. 2. phân tích Điện di (SDS-PAGE) của arginine aminopeptidase phần tích cực thu được trong các bước tinh chế khác nhau. Ngõ 1, đánh dấu trọng lượng phân tử (ngàn); làn 2, chiết xuất tế bào; ngõ 3, 50-70% ammonium sulfate cắt; ngõ 4, sắc ký phenyl-Sepharose; ngõ 5, Sephacryl 200 sắc ký nhân sự; . ngõ 6, sắc ký tài Q Xem bảng này: Trong cửa sổ này Trong một cửa sổ mới . BẢNG 1 lọc của arginine aminopeptidase từ L. sakei phân tử mass.The khối lượng phân tử của enzyme tinh khiết theo ước tính của SDS-PAGE phân tích là khoảng 60 kDa ( vả. 2, ngõ 6). Khối lượng phân tử tương đối của các enzyme tự nhiên ước tính bằng cách lọc gel trên một cột HR Sephacryl 200 là khoảng 180 kDa. Những kết quả này gợi ý rằng enzyme tinh khiết là một chất tam phân. Ảnh hưởng của pH và temperature.The enzyme tinh khiết cho thấy hoạt động trong một phạm vi pH hẹp (4,0-6,0), với tối ưu ở pH 5.0, trong cả hai natri axetat axit axetic-50 mM và 50 mM citric acid NaOH (hình 3). Hoạt động là không đáng kể tại các giá trị pH vượt quá 4.0 và 6.0. Hoạt động của enzyme tinh khiết là tối ưu ở 37 ° C, nhưng đã giảm mạnh ở mức 40 đến 45 ° C (Hình 3A). Việc giảm hoạt động của enzyme ở nhiệt độ cao không phải do một phân rã trong sự ổn định trong thời gian ủ bệnh (5 phút) (Hình 3 B). Ở nhiệt độ thấp như 6 đến 15 ° C, enzyme giữ lại 20-30% hoạt động tối ưu của nó (hình 3). FIG. . 3 Xem phiên bản lớn hơn: Trong trang này trong một cửa sổ mới Download như PowerPoint Slide FIG. 3. (A) Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ trên hoạt động aminopeptidase arginine từ L. sakei sử dụng Arg-AMC như một chất nền. Biểu tượng: ▴, hoạt động trong 50 mM citric acid NaOH ở pH khác nhau; ○, hoạt động trong 50 mM sodium acetate axit axetic-ở pH khác nhau; ▪, hoạt động ở nhiệt độ khác nhau. Hoạt động ở pH và nhiệt độ tối ưu đã được chỉ định một giá trị 100%. (B) Sự ổn định của arginine aminopeptidase ở nhiệt độ khác nhau: 30 ° C (•), 37 ° C (▪), 40 ° C (▴), và 45 ° C (▾). Hoạt động ban đầu đã được chỉ định một giá trị 100%. Ảnh hưởng của các chất hóa học và kim loại tác dụng cations.The quan sát thấy sự hiện diện của chất ức chế tiềm năng hoặc chất hoạt hoá của các enzym được thể hiện trong bảng 2 và 3. Các nhóm sulfhydryl thuốc thử iodoacetate hoạt động aminopeptidase ức chế hoàn toàn, trong khi các chất khử, đặc biệt là dithiothreitol, kích hoạt các enzyme. Những kết quả này gợi ý rằng nhóm sulfhydryl tham gia vào các hoạt động xúc tác. Tuy nhiên, các chất ức chế protease cysteine khác, xuyên epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino) butan (E-64), không ảnh hưởng hoạt động. Xem bảng này: Trong cửa sổ này Trong một cửa sổ mới BẢNG 2. Hiệu ứng của tác nhân hóa học về hoạt động của tinh khiết arginine aminopeptidase Xem bảng này: Trong cửa sổ này Trong một cửa sổ mới BẢNG 3. Ảnh hưởng của các cation kim loại về hoạt động của tinh khiết arginine aminopeptidase Các đại lý chelating EDTA có tác dụng kích thích (28-46%) trên hoạt động aminopeptidase arginine (Bảng 2). Các chất ức chế protease serine phenylmethylsulfonyl florua và 3,4-dichloroisocoumarin, cysteine và serine protease chất ức chế leupeptin, và các chất ức chế điển hình của exopeptidases, chẳng hạn như puromycin và bestatin, không có bất kỳ ảnh hưởng lớn đến hoạt động (Bảng 2). Sự hiện diện của Cu2 +, HG2 +, Zn2 + và gây ra một sự ức chế hoàn chỉnh ở mức 1.0 mM, trong khi ảnh hưởng ít rõ ràng hơn (10 đến 30% ức chế) đã được quan sát trong sự hiện diện của các cation hóa trị II còn lại (Bảng 3). Enzym đã được kích hoạt bằng cách tăng nồng độ NaCl, với tối đa ở mức 0.6 M (Hình 4). Sự hiện diện của nồng độ cao (0,5-3 M) của ammonium sulfate, được sử dụng trong các thủ tục thanh lọc, gây 40-75% ức chế hoạt động aminopeptidase (Hình 4). FIG. . 4 Xem phiên bản lớn hơn: Trong trang này trong một cửa sổ mới Download như PowerPoint Slide FIG. 4. Ảnh hưởng của NaCl (▪) và (NH4) 2SO4 (•) về hoạt động aminopeptidase arginine từ L. sakei sử dụng Arg-AMC như một chất nền. Hoạt động trong trường hợp không có bất kỳ muối được chỉ định một giá trị 100%. Substrate specificity.The enzyme tinh khiết là hoạt động duy nhất chống lại các AMC và PNA dẫn xuất của axit amin cơ bản (Bảng 4). Tỷ lệ thu được thủy phân với chất lysine có nguồn gốc từ chỉ khoảng 4% những người thu được với chất arginine có nguồn gốc từ. Các enzyme không cho thấy hoạt động endoproteinase, vì nó không thủy phân N-α-benzoyl-Arg-AMC (Bảng 4). Trong số tất cả dipeptides thử nghiệm, chỉ có những người có chứa dư lượng cơ bản ở vị trí N-thiết bị đầu cuối đã được thủy phân. Tỷ lệ thủy phân peptide với chuỗi Lys-X (trong đó X là viết tắt của Ala hay Lys) là khoảng 30% những người peptide với chuỗi Arg-X. Bản chất của dư lượng axit amin tại ga cuối C của dipeptides cũng có ảnh hưởng đến giá thủy phân. Hoạt động là tối đa đối với các peptide chứa hoặc Arg, Lys, hoặc Ala như dư lượng C-thiết bị đầu cuối của Arg-X dipeptides, trong khi sự hiện diện của Phe, Ile, Leu, hoặc ASP tại vị trí này làm giảm tỉ lệ thủy phân với các giá trị tương tự như những người thu được . với dipeptides có chứa lysine tại ga cuối N (Bảng 5) Xem bảng này: Trong cửa sổ này Trong một cửa sổ mới . BẢNG 4 hoạt động tương đối của tinh khiết aminopeptidase arginine trên khác nhau huỳnh quang (AMC-nguồn gốc) và đo màu (PNA-d
đang được dịch, vui lòng đợi..