REVIEWTransgenic pigs as models for

REVIEW
Transgenic pigs as models for translational biomedical research
Bernhard Aigner & Simone Renner & Barbara Kessler & Nikolai Klymiuk & Mayuko Kurome & Annegret Wünsch & Eckhard Wolf
Received: 1 September 2009 /Revised: 26 February 2010 /Accepted: 2 March 2010 /Published online: 26 March 2010 # Springer-Verlag 2010
Abstract The translation of novel discoveries from basic research to clinical application is a long, often inefficient, and thus costly process. Accordingly, the process of drug development requires optimization both for economic and for ethical reasons, in order to provide patients with appropriate treatments in a reasonable time frame. Consequently, “Translational Medicine” became a top priority in national and international roadmaps of human health research. Appropriate animal models for the evaluation of efficacy and safety of new drugs or therapeutic concepts are critical for the success of translational research. In this context rodent models are most widely used. At present, transgenic pigs are increasingly being established as large animal models for selected human diseases. The first pig whole genome sequence and many other genomic resources will be available in the near future. Importantly, efficient and precise techniques for the genetic modification of pigs have been established, facilitating the generation of tailored disease models. This article provides an overview of the current techniques for genetic modification of pigs and the transgenic pig models established for neurodegenerative diseases, cardiovascular diseases, cystic fibrosis, and diabetes mellitus.
Keywords Pig.Genetic engineering.Animal model. Translational medicine
Introduction
The term “Translational Medicine” is being increasingly used to describe strategies of developing discoveries in basic research into clinically applicable novel therapies [1]. Despite increased efforts and investments into research and development, the output of novel pharmaceuticals has declined dramatically over the past years. The phenomenon of a retarded entry of new drugs and diagnostics to the market in spite of increased scientific discoveries and major financial investments is often addressed as “pipeline problem” [2]. This is attributed to the fact that currently used in vitro models, animal models, and early human trials do not reflect the patient situation well enough to reliably predict efficacy and safety of a novel compound or device. Advanced insights into the molecular pathogenesis of diseases lead to a plethora of innovative therapeutic concepts which address defined molecular targets. However, the translation of these concepts into clinical application requires a serial and systematic evaluation of efficacy and safety all the way through from discovery, preclinical science to the phases of clinical testing. The “Critical Path Initiative” of the US Food and Drug Administration (http://www.fda.gov/oc/initiatives/critical path/) focuses on the scientific developments that are necessary to realize the required systematic processes and mechanisms of evaluation. One of the leading topics is “Biomarker Development”, since biomarkers play major roles both in early (e.g., testing of efficacy and safety in animal models) and late phases of drug development (e.g., establishment of dose–response profiles, evaluation of sideeffects). Therefore, biomarker discovery and validation are also central themes in the “Innovative Medicine Initiative (IMI)” of the European Union (http://www.imi-europe.org/).
B. Aigner:S. Renner:B. Kessler:N. Klymiuk:M. Kurome: A. Wünsch:E. Wolf (*) Chair for Molecular Animal Breeding and Biotechnology, Department of Veterinary Sciences; and Laboratory for Functional Genome Analysis (LAFUGA), Gene Center, LMU Munich, Feodor-Lynen-Str. 25, 81377 Munich, Germany e-mail: [e-mail]
J Mol Med (2010) 88:653–664 DOI 10.1007/s00109-010-0610-9
Biomarkers are objective and quantitative parameters that may serve as indicators of physiological processes, pathological changes as well as reactions to therapeutic intervention. The development of qualified biomarkers requires an integrated network of technology platforms. State-of-the-art technologies for molecular profiling at various levels (genome, transcriptome, proteome, metabolome, etc.) are connected with advanced techniques of bioimaging. Quantitative data from the different levels of information are integrated using the fast growing tools of bioinformatics and quantitative biology to optimize the predictionofefficacyandsafetyofnewdrugsandbiomarkers. Suitable animal models play a pivotal role in this process. Rodentmodelsare mostwidelyuseddue tothe possibility for genetic and environmental standardization, a broad spectrum of strains tailored to specific scientific problems, and their acceptancebytheregulatoryauthorities.Atpresent,transgenic pigs are increasingly established as additional large animal models for selected human diseases.
Pigs as models for translational research
Livestockpigbreedsandminiaturepigsarerelevantmodelsin many fields of medical research [3]. The omnivores human and pig have a large number of similarities in anatomy, physiology, metabolism, and pathology, e.g., they have a very similar gastrointestinal anatomy and function, pancreas morphology, and metabolic regulation. Moreover, pigs as large animal models are highly reproductive displaying early sexual maturity (with 5–8 months), a short generation interval (of 12 months), parturition of multiple offspring (an average of 10–12 piglets per litter), and all season breeding [4]. Standardization of the environment, i.e., pig housing,feeding,andhygienemanagement,iswelldeveloped [5]. Reproductive technology and techniques of genetic modification have considerably advanced in the last years (see below). Intense breeding efforts have provided pig breeds differing substantially in important traits such as size, metabolic characteristics, and behavior. If livestock pig breeds are employed for experimentation, the genetic background is mostly not defined. In contrast, minipig outbred stocks with full pedigree are delivered from commercial suppliers (http://www.minipigs.com/). In addition, inbred minipigs are available [6, 7]. Some pig breeds such as the Göttingen minipig® are used as non-rodent models for pharmacological and toxicological studies and are fully accepted by regulatory authorities worldwide (http:// www.minipigs.com/). As a member of the artiodactyls (cloven-hoofed mammals), the pig is evolutionarily distinct from the primates and rodents [8]. An initial evolutionary analysis based on
∼3.84 million shotgun sequences (0.66× coverage of the pig genome) and the available human and mouse genome data revealed that for each of the types of orthologous sequences investigated (e.g., exonic, intronic, intergenic, 5′ UTR, 3′ UTR, and miRNA), the pig is closer to human than mouse [9]. This was confirmed by the comparative analysis of protein coding sequences using full-length cDNA alignments comprising more than 700 kb from human, mouse, and pig where most gene trees favored a topology with rodents as outgroup to primates and artiodactyls [10]. A draft sequence of the whole pig genome is expected to be completed in the near future. The sequence data are being released through Ensembl (http://www.ensembl.org/Sus_ scrofa/Info/Index) as sequencing progresses. In addition to the genome-sequencing project, efforts were made in several groups to identify single nucleotide polymorphisms (SNP) through a substantial amount of shallow sequencing of additional breeds, resulting in a high-density (60 k) SNP chip distributed by Illumina, Inc. [11]. Recently, the so far largest collection of more than one million porcine-expressed sequence tags (ESTs) from 35 different tissues and three developmental stages was analyzed. This EST collection represents an essential resource for annotation, comparative genomics, assembly of the pig genome sequence, and further porcine transcriptome studies [12].
Genetic engineering of pigs
Importantly, pigs can be genetically modified to recapitulate the genetic and/or functional basis of a particular human disease, resulting in refined and tailored animal models for translational biomedical research. Current techniques for the genetic modification of pigs include DNA microinjection into the pronuclei of fertilized oocytes (DNA-MI), spermmediated gene transfer (SMGT), lentiviral transgenesis (LVGT), and somatic cell nuclear transfer using genetically modified nuclear donor cells (SCNT; Fig. 1). Other large non-primate animal models for human diseases include dogs and rabbits. Reproductive as well as transgenic techniques are poorly developed for dogs. Transgenic rabbits were produced using additive gene transfer, but no targeted mutations were introduced in the rabbit genome to date. In addition, the rabbit genome is sequenced only to a low coverage (http://www.ensembl.org).
Pronuclear DNA microinjection
The first technique successfully used to produce transgenic pigs was DNA microinjection into pronuclei of zygotes [13, 14]. Generally, the efficiency of DNA microinjection is low. In addition, pronuclear DNA microinjection suffers from the fact that it may yield founder animals that are
654 J Mol Med (2010) 88:653–664
mosaic, and that random integration of the injected DNA fragments may cause varying expression levels due to position effects of the neighboring DNA or may disrupt functional endogenous sequences (insertional mutagenesis; reviewed in [4]). In spite of the overall low efficiency, probably most of the transgenic pig lines existing so far have been established by the pronuclear microinjection technique.
Sperm-mediated gene transfer
SMGT is based on the intrinsic ability of sperm to bind and internalize exogenous DNA and to transfer it into the egg during fertilization (reviewed in [15]). Although the efficiency of SMGT was discussed controve

Kết quả (Việt) 1:

ĐÁNH GIÁBiến đổi gen con lợn là mô hình cho nghiên cứu y sinh tịnhBernhard Seehofer & Simone Renner & Barbara Kessler & Nikolai Klymiuk & Mayuko Kurome Annegret Wünsch & Eckhard WolfNhận được: 1 tháng 9 năm 2009/sửa đổi: tháng 2 năm 2010/chấp nhận: 2 tháng ba 2010 /Published trực tuyến: 26 Tháng ba năm 2010 # Springer-Verlag 2010Tóm tắt các bản dịch của tiểu thuyết phát hiện từ nghiên cứu cơ bản để ứng dụng lâm sàng là một quá trình dài, thường không hiệu quả, và do đó tốn kém. Theo đó, quá trình phát triển thuốc yêu cầu tối ưu hóa cả hai cho kinh tế và vì lý do đạo Đức, để cung cấp cho bệnh nhân với phương pháp điều trị thích hợp trong một khung thời gian hợp lý. Do đó, "Translational y học" đã trở thành một ưu tiên hàng đầu trong nước và quốc tế roadmaps nghiên cứu sức khỏe con người. Phù hợp các mô hình động vật để đánh giá hiệu quả và an toàn của loại thuốc mới hoặc điều trị khái niệm rất quan trọng cho sự thành công của nghiên cứu translational. Trong bối cảnh này động vật gặm nhấm mô hình được sử dụng rộng rãi nhất. Hiện nay, biến đổi gen con lợn đang ngày càng được thành lập như là mô hình động vật lớn đối với bệnh nhân đã chọn. Trình tự đầu tiên toàn bộ bộ gen con lợn và nhiều tài nguyên gen khác sẽ có sẵn trong tương lai gần. Quan trọng, hiệu quả và chính xác để sửa đổi di truyền của con lợn kỹ thuật đã được thành lập, tạo điều kiện cho các thế hệ của mô hình bệnh phù hợp. Bài viết này cung cấp một tổng quan về các kỹ thuật hiện tại cho các sửa đổi di truyền của con lợn và các mô hình biến đổi gen con lợn thành lập cho bệnh neurodegenerative, bệnh tim mạch, xơ nang, và bệnh tiểu đường.Từ khóa kỹ thuật Pig.Genetic. Động vật mô hình. Translational y họcGiới thiệuThuật ngữ "Translational y học" đang ngày càng được sử dụng để mô tả các chiến lược phát triển được phát hiện trong nghiên cứu cơ bản thành tiểu thuyết phương pháp điều trị lâm sàng áp dụng [1]. Mặc dù gia tăng nỗ lực và đầu tư vào nghiên cứu và phát triển, sản lượng của cuốn tiểu thuyết dược phẩm đã giảm đáng kể trong những năm qua. Hiện tượng một mục nhập chậm của loại thuốc mới và chẩn đoán để thị trường mặc dù tăng khám phá khoa học và đầu tư tài chính lớn thường được gọi là "đường ống dẫn vấn đề" [2]. Điều này là do thực tế rằng hiện đang được sử dụng các mô hình trong ống nghiệm, mô hình động vật và thử nghiệm của con người đầu không phản ánh tình trạng bệnh nhân cũng đủ đáng tin cậy có thể dự đoán hiệu quả và an toàn của một cuốn tiểu thuyết hợp chất hoặc thiết bị. Những hiểu biết tiên tiến vào phân tử sinh bệnh học của bệnh dẫn đến một plethora của sáng tạo điều trị khái niệm địa chỉ đó xác định mục tiêu phân tử. Tuy nhiên, các bản dịch của các khái niệm vào lâm sàng ứng dụng đòi hỏi một nối tiếp và có hệ thống đánh giá hiệu quả và an toàn tất cả các cách thông qua từ khám phá, preclinical khoa học cho giai đoạn thử nghiệm lâm sàng. Các "quan trọng con đường sáng kiến" của thực phẩm Mỹ và Cục quản lý dược (con đường http://www.fda.gov/oc/initiatives/critical /) tập trung vào sự phát triển khoa học cần thiết để nhận ra các yêu cầu quá trình có hệ thống và cơ chế của đánh giá. Một trong các chủ đề hàng đầu là "Biomarker phát triển", kể từ khi biomarkers vai trò chính cả trong sớm (ví dụ như, thử nghiệm của hiệu quả và an toàn trong các mô hình động vật) và các giai đoạn cuối của phát triển ma túy (ví dụ như, thành lập hồ sơ liều-phản ứng, đánh giá của sideeffects). Vì vậy, biomarker phát hiện và xác nhận là cũng chủ đề Trung tâm trong các "sáng tạo y học sáng kiến (IMI)" của liên minh châu Âu (http://www.imi-europe.org/).B. Aigner:S. Renner: sinh Kessler:N. Klymiuk:M. Kurome: A. Wünsch:E. Wolf (*) ghế cho chăn nuôi động vật phân tử và công nghệ sinh học, sở thú y khoa học; và phòng thí nghiệm để phân tích bộ gen chức năng (LAFUGA), Gene Trung tâm, Mu-ních LMU, Feodor Lynen Str. 25, 81377 Mu-ních, Đức-e-mail: [e-mail]88:653 J Mol Med (2010)-664 DOI 10.1007/s00109-010-0610-9Biomarkers là mục tiêu và tham số định lượng mà có thể phục vụ như là chỉ số của quá trình sinh lý, thay đổi bệnh lý cũng như các phản ứng với điều trị can thiệp. Sự phát triển của biomarkers đủ điều kiện đòi hỏi một mạng tích hợp của nền tảng công nghệ. Nhà nước-of-the-nghệ thuật công nghệ cho profiling phân tử ở các cấp độ (bộ gen, transcriptome, proteome, metabolome, vv) được kết nối với các kỹ thuật tiên tiến của bioimaging. Các dữ liệu định lượng từ các cấp độ khác nhau của thông tin được tích hợp bằng cách sử dụng các công cụ phát triển nhanh chóng của tin sinh học và định lượng sinh học để tối ưu hóa các predictionofefficacyandsafetyofnewdrugsandbiomarkers. Phù hợp các mô hình động vật đóng một vai trò then chốt trong quá trình này. Rodentmodelsare mostwidelyuseddue cho khả năng di truyền và môi trường tiêu chuẩn, một phổ rộng của các giống phù hợp với vấn đề khoa học cụ thể, và acceptancebytheregulatoryauthorities của họ. Atpresent, biến đổi gen con lợn đang ngày càng được thành lập như là mô hình động vật lớn bổ sung cho lựa chọn của con người bệnh.Lợn là mô hình cho nghiên cứu translationalLivestockpigbreedsandminiaturepigsarerelevantmodelsin nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học [3]. Các động vật ăn tạp của con người và lợn có nhiều điểm tương đồng trong giải phẫu, sinh lý học, sự trao đổi chất và bệnh lý, ví dụ, họ đã rất tương tự như tiêu hóa giải phẫu và chức năng, tuyến tụy hình Thái và quy định trao đổi chất. Hơn nữa, con lợn là mô hình động vật lớn đánh giá cao sinh sản Hiển thị đầu tình dục trưởng thành (với 5-8 tháng), một khoảng thời gian ngắn thế hệ (của 12 tháng), điểm của nhiều con cái (trung bình khoảng 10-12 heo con một rác), và tất cả mùa sinh sản [4]. Tiêu chuẩn môi trường, tức là, lợn nhà ở, cho ăn, andhygienemanagement, iswelldeveloped [5]. Công nghệ sinh sản và kỹ thuật của sửa đổi di truyền có nâng cao đáng kể trong năm qua (xem bên dưới). Những nỗ lực mạnh mẽ chăn nuôi đã cung cấp lợn giống khác nhau đáng kể trong các đặc điểm quan trọng chẳng hạn như kích thước, đặc điểm trao đổi chất, và hành vi. Nếu vật nuôi lợn giống được tuyển dụng cho thử nghiệm, nền di truyền chủ yếu là không xác định. Ngược lại, minipig outbred cổ phiếu với đầy đủ giống đã được gửi từ nhà cung cấp thương mại (http://www.minipigs.com/). Ngoài ra, minipigs tự nhiên có sẵn [6, 7]. Một số giống lợn chẳng hạn như Göttingen minipig ® được sử dụng như là mô hình chuột cho nghiên cứu dược lý và giấy và hoàn toàn chấp nhận bởi các cơ quan pháp lý trên toàn thế giới (http:// www.minipigs.com/). Là một thành viên của Artiodactyla (động vật có vú cloven-hoofed), con lợn là tiến hóa khác biệt với các loài linh trưởng và động vật gặm nhấm [8]. Một phân tích tiến hóa ban đầu dựa trên∼3.84 triệu shotgun chuỗi (0.66 × bảo hiểm của bộ gen lợn) và có con chuột gen dữ liệu tiết lộ rằng đối với mỗi loại orthologous chuỗi điều tra (ví dụ như, exonic, intronic, intergenic, 5 ' Maldegem, 3 ' Maldegem, và Tam), lợn là gần gũi hơn với con người hơn chuột [9]. Điều này đã được xác nhận bằng cách phân tích so sánh của protein mã hóa trình tự bằng cách sử dụng sự sắp xếp đầy đủ độ dài cDNA bao gồm hơn 700 kb từ con người, con chuột, và lợn nơi hầu hết gen cây ưa chuộng một cấu trúc liên kết với động vật gặm nhấm như outgroup động vật linh trưởng và Artiodactyla [10]. Một dự thảo chuỗi bộ gen cả lợn dự kiến sẽ được hoàn thành trong tương lai gần. Các trình tự dữ liệu đang được phát hành thông qua Ensembl (http://www.ensembl.org/Sus _ scrofa/thông tin/Index) theo trình tự tiến hành. Ngoài dự án trình tự bộ gen, những nỗ lực đã được thực hiện trong một số nhóm để xác định nucleotide đơn polymorphisms (SNP) thông qua một số lượng đáng kể của các trình tự nông giống bổ sung, kết quả là mật độ cao (60 k) SNP chip phân phối bởi Illumina, Inc [11]. Gần đây, bộ sưu tập lớn nhất cho đến nay của nhiều hơn một triệu porcine bày tỏ chuỗi tags (ESTs) từ 35 mô khác nhau và ba giai đoạn phát triển được phân tích. Bộ sưu tập EST này đại diện cho một nguồn tài nguyên cần thiết cho chú thích, gen so sánh, hội lợn chuỗi bộ gen, và tiếp tục nghiên cứu porcine transcriptome [12].Kỹ thuật di truyền của con lợnQuan trọng, con lợn có thể được biến đổi để recapitulate cơ sở di truyền và/hoặc chức năng của một người bệnh cụ thể, kết quả là tinh tế và phù hợp các mô hình động vật cho nghiên cứu y sinh tịnh tiến. Bao gồm các kỹ thuật hiện tại để sửa đổi di truyền của con lợn DNA microinjection vào pronuclei của thụ tinh oocytes (DNA-MI), chuyển giao cho gen spermmediated (SMGT), lentiviral transgenesis (LVGT), và tế bào Soma hạt nhân chuyển sử dụng biến đổi nhà tài trợ hạt nhân tế bào (SCNT; Hình 1). Các mô hình động vật linh trưởng phòng không lớn cho bệnh của con người bao gồm chó và thỏ. Kỹ thuật sinh sản cũng như biến đổi gen kém phát triển cho chó. Thỏ biến đổi gen đã được sản xuất bằng cách sử dụng chuyển khoản phụ gia gen, nhưng không có đột biến được nhắm mục tiêu được giới thiệu trong bộ gen thỏ đến nay. Ngoài ra, bộ gen thỏ trình tự chỉ đến một phạm vi bảo hiểm thấp (http://www.ensembl.org).Pronuclear DNA microinjectionCác kỹ thuật đầu tiên thành công được sử dụng để sản xuất biến đổi gen con lợn là DNA microinjection vào pronuclei của zygotes [13, 14]. Nói chung, hiệu quả của DNA microinjection là thấp. Ngoài ra, pronuclear DNA microinjection bị từ thực tế là nó có thể mang lại động vật sáng lập654 J Mol Med (2010) 88:653-664Mosaic, và rằng các tích hợp ngẫu nhiên của DNA tiêm mảnh có thể gây ra mức độ biểu hiện khác nhau do vị trí tác động của DNA giáp ranh hoặc có thể phá vỡ chức năng nội sinh chuỗi (insertional mutagenesis; xem xét trong [4]). Mặc dù hiệu quả nói chung thấp, có lẽ hầu hết các dòng biến đổi gen lợn sẵn có cho đến nay đã được thành lập bởi kỹ thuật pronuclear microinjection.Gen tinh trùng trung gian chuyển giaoSMGT dựa trên khả năng nội tại của tinh trùng để ràng buộc và trong lòng ngoại sinh DNA và chuyển nó vào trứng trong thụ tinh (xem xét trong [15]). Mặc dù hiệu quả của SMGT là controve thảo luận