For the construction of nuclear gen

For the construction of nuclear genomic libraries, nuclear-en-riched DNA was isolated from 40 g of young fresh leaf tissue.
This was cut in small pieces, soaked for 2 rain in cold diethyl ether, and ground with a Waring blender homogenizer (5 x 3 s, low speed) in 100 ml of extraction buffer [0.4 M sucrose, 0.05 M Tris-HC1 pH 8, 2mM CaC12, 0.03% ~ mercaptoethanol (v/v)l.
The resulting suspension was filtered through a 150-pm-mesh nylon net, then through a 48 gm~mesh nylon net, and finally
centrifuged for 10min at 400g. The pellet was gently resuspended in 10 ml of buffer A (0.25 M sucrose, 0.05 M Tris-HClpH 8, 2 mM CaC12). The solution was carefully layered over 3 vol of a sucrose buffer (2 M sucrose, 0.05 M Tris-HC1 pH 8, 2 mM CaCla) contained in a soft Teflon tube. Ultracentrifugation was performed in a swing rotor for 45 rain at 30,000 g. The resulting pellet was dispersed in 10 ml of buffer A with a smooth brush, and the suspension was centrifuged for 10rain at 1,600 g.
All the previous steps were performed at 4 ~ Nucleus enrichment was checked by microscopic examination after DAPI (4',6-diami-dino-2-phenyl-indole) staining. For nuclear lysis, the pellet was resuspended in 10ml of buffer B (150raM NaCI, 10raM EDTA, 50raM Tris-HC1 pH 7.5,2% SDS) and incubated for 30 min at 65 ~ Nuclear debris was pelleted by centrifugation for 30 min at 4000 g. NaC1 was added to the supernatant to a final concentration of 1.4M. A 1/10 vol of CTAB (mixed alkyl-trimethylammonium bromide) solution (10% CTAB, 500mM Tris-HC1 pH 8, 100 mM EDTA) was then added and the mixture was incubated with gentle stirring for 10rain at 65 ~ One volume of chloroform:isoamylalcohot (24:1) was added and, after mixing, the solution was centrifuged for 5 min at 3,500 g at 20 ~ The supernatant was mixed with 2.5 vol of ethanol to
precipitate high-molecular-weight DNA which was then washed in 76% ethanol-0.2 M NaOAc and resuspended in TE (10 mM Tris-HC1 pH 8, 1 mM EDTA pH 8). RNase digestion was performed for 45min at 37~ A final standard phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) extraction was carried out to further purify the DNA. Nuclear DNA was digested with either
EcoRI or PstI and was then size-separated on a 10 40% sucrose gradient (Sambrook et al. 1989). Two ligation reactions were performed according to insert size range (0.7-2 kb, 2.5-5kb). Fragments were ligated into pBluescript or pUC18 plasmids (insert 3 : plasmid 1) following the manufacturer's instructions for T4 DNA ligase (BRL). DH5~ bacterial cells were then transformed with ligated plasmids (Chung and Miller 1988) and selection of transformed colonies was performed following X-
Gal and IPTG screening procedures. Plasmid minipreparations
were according to Birnboim and Doly (1979). The libraries were
screened for copy number by probing total DNA onto Southern
blots of the probes. A wheat rDNA unit repeat clone (Gerlach
and Bedbrook 1979) and pea Adh clone (Llewellyn et al. 1987)
were used as intensity controls. The probes were classified into
two categories based on the relative intensity of the detected
signal. Clones were named pMaCIR#. Numbers greater than
1000 corresponded to the EcoRI library probes. Insert size was
determined relative to a Raoul (Appligene) molecular weight
marker using a computer-driven autoradiograph digitizer
(Hoisington and Gonzfilez de Ledn, in preparation).
For Southern and PCR analyses, total DNA was extracted
according to Dellaporta et al. (1983), with modifications by
Cordesse et al. (1990). The DNAs of nine banana clones (SF265,
Banksii, and seven individuals representative of M. acuminata
diversity) cut with one of ten restriction enzymes, were surveyed
for restriction polymorphism using 13 genomic probes (data not
shown). EcoRV and DraI were selected for the mapping work.
Digestions were performed according to supplier's recommenda-
tions (BRL), but with 2.5 units/gg DNA of restriction enzyme.
Restricted DNA (10gg/lane) was separated in 0.8~-TAE
agarose gels at 1.04 V/cm for 9 h. The gels were depurinated in 0.25 N HC1 for 10 min, denatured in 0.4 N NaOH for 30 min, and then blotted onto Hybond N + membranes (Amersham).
Probes were labeled with a2p-c~dCTP using the random primer labelling method of Feinberg and Vogelstein (1983).
Incorporation of radioactive nucleotides was checked by chromatography on PEI-cellulose F. Prehybridization, hybridization and washes were performed in a hybridization o

Kết quả (Việt) 2:

Đối với việc xây dựng thư viện gen hạt nhân, DNA hạt nhân-en-riched được phân lập từ 40 g mô lá tươi trẻ.
Điều này đã được cắt ra từng mảnh nhỏ, ngâm trong 2 mưa trong ête diethyl lạnh, và mặt đất với một máy xay sinh tố đồng hóa Waring (5 x 3 s, tốc độ thấp) trong 100 ml dung dịch đệm chiết [0,4 M sucrose, 0,05 M Tris-HC1 pH 8, 2mm CaC12, 0,03% ~ mercaptoethanol (v / v) l.
Việc đình chỉ kết quả được lọc qua một 150-am -mesh nylon net, sau đó thông qua một 48 gm ~ lưới nylon ròng, và cuối cùng là
ly tâm cho 10min tại 400g. Các viên đã nhẹ nhàng lơ lửng trong 10 ml dung dịch đệm A (0,25 M sucrose, 0,05 M Tris-HClpH 8, 2 mM CaC12). Giải pháp đã được lớp cẩn thận hơn 3 vol của một bộ đệm sucrose (2 M sucrose, 0,05 M Tris-HC1 pH 8, 2 mM CaCla) chứa trong một ống Teflon mềm. Siêu ly tâm đã được thực hiện trong một cánh quạt xoay 45 mưa ở 30.000 g. Các viên kết quả đã được phân tán trong 10 ml dung dịch đệm A với một bàn chải mịn, và hệ thống treo được ly tâm cho 10rain tại 1.600 g.
Tất cả các bước trước đó đã được thực hiện tại 4 ~ Nucleus làm giàu được kiểm tra bằng kính hiển vi sau DAPI (4 ', 6 -diami-khủng long-2-phenyl-indol) nhuộm. Đối với ly giải hạt nhân, viên đang lơ lửng trong 10ml đệm B (150raM Naci, 10raM EDTA, 50raM Tris-HC1 pH 7.5,2% SDS) và ủ trong 30 phút ở 65 ~ mảnh vỡ hạt nhân đã được ăn viên bằng cách ly tâm trong 30 phút ở 4000 g. NaC1 đã được thêm vào nổi đến một nồng độ cuối cùng của 1.4M. Một vol 1/10 CTAB (hỗn hợp alkyl-trimethylamoni bromide), giải pháp (10% CTAB, 500mm Tris-HC1 pH 8, 100 mM EDTA) sau đó được thêm vào và hỗn hợp được ủ với khuấy nhẹ nhàng cho 10rain 65 ~ Một khối lượng chloroform: isoamylalcohot (24: 1) đã được bổ sung và, sau khi trộn, các giải pháp được ly tâm trong 5 phút ở 3.500 g ở 20 ~ sự nổi được trộn với 2,5 vol ethanol để
kết tủa DNA trọng lượng phân tử cao sau đó được rửa sạch trong 76% ethanol 0,2 M NaOAc và lơ lửng trong TE (10 mM Tris-HC1 pH 8, 1 mM EDTA pH 8). RNase tiêu hóa đã được thực hiện cho 45min ở 37 ~ Một phenol tiêu chuẩn cuối cùng: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) khai thác được thực hiện để làm sạch thêm DNA. DNA hạt nhân đã được tiêu hóa với một trong hai
EcoRI hoặc PstI và sau đó đã được kích thước phân cách trên một gradient sucrose 10 40% (Sambrook và cộng sự. 1989). Hai phản ứng thắt đã được thực hiện theo nhiều kích thước chèn (0,7-2 kb, 2.5-5kb). Những mảnh vỡ được gắn vào pBluescript hoặc pUC18 plasmid (chèn 3: plasmid 1) theo hướng dẫn của nhà sản xuất cho T4 DNA ligase (BRL). DH5 ~ tế bào vi khuẩn này sau đó được chuyển đổi với plasmid ligated (Chung và Miller 1988) và lựa chọn của các thuộc địa biến đổi đã được thực hiện sau đây X-
Gal và thủ tục kiểm tra IPTG. Minipreparations plasmid
là theo Birnboim và Doly (1979). Các thư viện đã được
chiếu cho số lượng bản sao bằng cách thăm dò DNA tổng số lên miền Nam
blots của đầu dò. Một rDNA mì đơn vị lặp lại clone (Gerlach
và Bedbrook 1979) và hạt đậu ADH clone (Llewellyn et al. 1987)
đã được sử dụng như điều khiển cường độ. Các đầu dò được phân thành
hai loại dựa vào cường độ tương đối của các phát hiện
tín hiệu. Dòng vô tính đã được đặt tên pMaCIR #. Số lớn hơn
1000 tương ứng với các thiết bị thăm dò thư viện EcoRI. Chèn kích thước được
xác định tương đối với một Raoul (Appligene) trọng lượng phân tử
đánh dấu bằng một số hóa autoradiograph máy tính điều khiển
(Hoisington và Gonzfilez de Ledn, để chuẩn bị).
Đối với miền Nam và PCR phân tích, tổng DNA được chiết xuất
theo Dellaporta et al. (1983), với sửa đổi bởi
Cordesse et al. (1990). Các DNA trong chín nhái chuối (SF265,
Banksii, và bảy cá nhân đại diện của M. acuminata
đa dạng) cắt bằng một trong mười enzim giới hạn, đã được khảo sát
để hạn chế tính đa hình sử dụng 13 đầu dò gen (dữ liệu không
hiển thị). EcoRV và Drai đã được lựa chọn cho công việc lập bản đồ.
Phá mẫu được thực hiện theo khuyến cáo của nhà cung cấp
tions (BRL), nhưng với 2,5 đơn vị / DNA gg của enzyme giới hạn.
Restricted DNA (10gg / làn) được tách ra trong 0,8 ~ -TAE
gel agarose tại 1.04 V / cm cho 9 h. Các gel được depurinated trong 0,25 N HC1 trong 10 phút, biến tính trong 0,4 N NaOH trong 30 phút, và sau đó xoá nhoà vào Hybond N + màng (Amersham).
Đầu dò được dán nhãn A2P-c ~ dCTP sử dụng phương pháp ghi nhãn mồi ngẫu nhiên của Feinberg và Vogelstein (1983).
Kết hợp nucleotide phóng xạ được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký trên PEI-cellulose F. Prehybridization, lai tạo và rửa được thực hiện trong một o lai