Research MinicyclerTM. The thermocy

Research MinicyclerTM. The thermocycling profile consisted of an initial denaturation at 94°C for 2 min, followed by 35 cycles of denaturation at 94°C for 1 min, annealing at 40°C for 1 min, 72°C for 2 min, and the final 5 min extension at 72°C. The amplified products were resolved by electrophoresis in 1.2% (w/v) agarose gels (added with ethidium bromide) run at 125 V in Tris-boric acid-EDTA buffer. The electrophorograms were recorded using gel AlphaImager documentation analysis system (Alpha Innotech, USA). DNA ladder of 100 bp was used as marker (Genei, Bangalore, India). The experiments were repeated twice with independently extracted DNA for confirmation.
Determination of plumbagin in methanolic extract by HPLC analysis
Roots of two-year-old field-grown plants, in vitro control, and different hairy root lines with or without the treatment of elicitors were harvested for extraction of plumbagin. In order to determine the optimal time of the highest yield of plumbagin, the roots cultured in half-strength MS liquid medium were collected at 30, 40, 50, and 60 d after culture. Based on this result, in all other cases the transformed roots grown on half-strength MS solid and liquid medium collected at 50 d were used for the extraction. The oven-dried (40°C) roots samples were ground to fine powder, and 500 mg (50 mg in the case of in vitro control) was extracted thrice with methanol (3 mL each) separately. The pooled extracts concentrated under vacuum were dissolved in a minimal volume of HPLC-mobile phase, and were filtered using 0.22 mM filter (Millipore). HPLC analysis of plumbagin was performed out as described by Komaraiah et al. (2001, 2003) using two Shimadzu LC 10 AS pumps; SPD 10 A UV-VIS detector, and C18 column (4 mm dia and 250 mm length) with a detection at 254 nm. The mobile phase was methanol:water (80:20) with 0.1% trifluoroacetic acid and the peak area was calculated by comparing with an authentic sample of plumbagin (Hi-Media, Mumbai, India).
Elicitation
Elicitation of plumbagin production was carried out by adding different levels (50, 100, and 200 mM) of methyl jasmonate (MJ) and acetylsalicylic acid (AS) to 48-day-old R5 hairy root line cultures in half-strength MS liquid medium and harvesting after 48 h of treatment. Further, the optimal levels of MJ (50 µM) and AS (100 µM) were added to 45-, 48-, and 51- day-old roots culture and the amount of plumbagin was determined by

Kết quả (Việt) 2:

Nghiên cứu MinicyclerTM. Các hồ sơ thermocycling gồm một biến tính ban đầu ở 94 ° C trong 2 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ của sự biến tính ở 94 ° C trong 1 phút, ủ ở 40 ° C trong 1 phút, 72 ° C trong 2 phút, và cuối cùng 5 min mở rộng ở 72 ° C. Các sản phẩm khuếch đại đã được giải quyết bằng điện trong 1,2% (w / v) gel agarose (thêm với ethidium bromide) chạy ở 125 V trong Tris-boric acid-EDTA đệm. Các electrophorograms đã được ghi lại bằng cách sử dụng gel AlphaImager hệ thống phân tích tài liệu (Alpha Innotech, USA). Thang DNA 100 bp đã được sử dụng như là điểm đánh dấu (Genei, Bangalore, Ấn Độ). Các thí nghiệm được lặp lại hai lần với DNA chiết xuất độc lập để xác nhận.
Xác định plumbagin trong methanol bằng HPLC phân tích
Roots của nhà máy lĩnh vực trồng hai tuổi, trong ống nghiệm kiểm soát, và dòng gốc lông khác nhau có hoặc không điều trị elicitor là thu hoạch cho khai thác của plumbagin. Để xác định thời gian tối ưu năng suất cao nhất của plumbagin, rễ nuôi trong nửa độ mạnh môi trường MS lỏng được thu thập tại 30, 40, 50, và 60 ngày sau khi nuôi cấy. Dựa trên kết quả này, trong tất cả các trường hợp khác, rễ chuyển đổi trồng trên một nửa sức mạnh MS môi trường rắn và lỏng thu thập tại 50 d đã được sử dụng cho việc khai thác. Các lò sấy khô (40 ° C) rễ mẫu được nghiền thành bột mịn, và 500 mg (50 mg trong trường hợp in vitro kiểm soát) được chiết xuất ba lần với methanol (3 mL mỗi) một cách riêng biệt. Các chất chiết xuất gộp lại tập trung dưới chân không được hòa tan trong một lượng tối thiểu của các giai đoạn HPLC-mobile, và đã được lọc bằng 0,22 mM lọc (Millipore). Phân tích HPLC của plumbagin được thực hiện như mô tả bởi Komaraiah et al. (2001, 2003) sử dụng hai Shimadzu LC 10 AS bơm; SPD 10 A UV-VIS dò, và C18 cột (4 mm dia và chiều dài 250 mm) với một phát hiện ở 254 nm. Pha động là methanol: nước (80:20) với 0,1% axit trifluoroacetic và vùng đỉnh đã được tính toán bằng cách so sánh với một mẫu đích thực của plumbagin (Hi-Media, Mumbai, Ấn Độ).
khơi gợi
sự khám phá của sản plumbagin được thực hiện bởi thêm mức độ khác nhau (50, 100, và 200 mM) methyl jasmonate (MJ) và acid acetylsalicylic (AS) để R5 nền văn hóa dòng gốc lông 48 ngày tuổi trong nửa độ mạnh môi trường MS lỏng và thu hoạch sau 48 giờ điều trị. Hơn nữa, mức độ tối ưu của MJ (50 mM) và AS (100 mM) đã được thêm vào 45-, sau 48 giờ, và văn hóa rễ 51. ngày tuổi và số lượng của plumbagin được xác định bằng