ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF X

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF XANTHOMONAS
ORYZAE PV. ORYZAE ISOLATES FROM NORTH
WEST FRONTIER PROVINCE (NWFP) PAKISTAN
ABSTRACT
Xanthomonas oryzae pv. oryzae, the causal agent of bacterial leaf blight (BLB) of rice was characterized through
pathogenecity and biochemical assays. Plant samples were collected from major agro-ecological rice zones including
Lower Dir, Swat and Agricultural Research Station, Mingora in NWFP during 2002. The isolates obtained were
subjected to pathogenecity test on six rice cultivars that varied significantly in terms of disease severity among each
other. However, non-significant results were recorded when clip and pinprick methods of leaf inoculation
were compared for pathogenecity test. The isolates were also subjected to different biochemical tests and were found to
be negative for Oxidase, Lecithinase and Gram reactions. Results of biochemical tests like Tween 80 and Starch
Hydrolysis, Anaerobic nature and Acid Production from Carbohydrates varied among the isolates. Only 20% isolates
were similar in terms of their reactions to these tests. Based on biochemical responses it was established that despite the
small sample size (n=15) genetic variability was detected in Xathamonas oryzae pv. oryzue isolates.
Rice is grown in tropical and subtropical regions
of the world and is a staple food for around 2.7
billion people worldwide (Salim et al., 2003).
Rice is ranked second in Pakistan in terms of
area under cultivation and production after wheat
crop (Agriculture Statistics of Pakistan, 2003-
2004). Apart from being Pakistan's important
crop, rice is also a major export item and
contributed Rs. 36534.7 millions to the national
exchequer during the fiscal year 2003-2004
(Agriculture Statistics of Pakistan, 2003-2004).
Pakistan's Super Basnuui and Kernal rice are
world famous for their invigorating aroma and
The rice crop is susceptible to a number of
diseases among which the bacterial blight of rice
caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzac
Swings et al., 1990) has been an important
constraint to rice production in Asia (Lozano,
1981). In Pakistan, this disease was reported first
during 1977 (Mew and Majid, 1977). The
bacterium can infect rice from seedling stage to
mature plant and the disease is manifested by
either ‘leaf blight’ or ‘kresek’ symptoms. During
he leaf blight phase, causal organism enters the
plant through wounds or through water pores
ocated on the margins of upper part of the
eaves, producing lesions, which are water
soaked, yellow with irregular, wavy margins and
progresses down the leaves. The lesion usually
starts from the leaf margin near its tip. Bacterial
ooze, which consists of small, yellowish,
spherical masses, may sometimes be seen on the
margins or veins of the freshly infected leaf
under moist conditions. On the other hand, the
Kresek phase is a systemic phase during which
acute wilting of the seedlings take place. This
symptom usually appears one or two weeks after
transplanting. Leaves turn grayish green, wither
suddenly and roll upwards. The Kresek phase
was first reported from Indonesia and was later
reported to occur in most of the rice growing
areas in the tropics (Reitsma and Sehure, 1950).
BLB under mild infection causes yield reduction
ranging from 10-12% (Mew et al., 1993)
whereas under severe condition, it can be as high
as 50% (Ou, 1985). During milling. The grains
from blighted plant are easily broken. The
purpose of this study was to isolate and
characterize different strains of the causal agent
from NWFP using pathogenecity bioassay and
biochemical tests. This is expected to provide
first hand information on the pathogen and the
database thus developed could be used in
developing cultivars with durable resistance
against the pathogen in future studies.

MATERIALS AND METHODS
Isolation
Ninety samples of rice at panicle initiation stage,
showing typical bacterial blight symptoms were
collected comprising of eight samples from
Lower Dir, 36 from Agricultural Research
Station, Mingora and 46 from Swat regions of
NWFP. Diseased leaf pieces (2x7 mm) were
surface sterilized with 1% Clorox and transferred
to Petri plates containing Yeast-Extract-Caleium-
Carbonate (YDC) agar medium using three
replicates and incubated at 25 -27o
C for 72 hrs
(Wilson et al. 1967). Yellow, mucoid, doom
shaped colonies with entire margins developed
that were further sub-cultured. Cultures were
preserved for longer duration (at 40
C) by
pipetting 0.5ml of an inoculated heavy nutrientbroth solution into a tube of sterile, sandy-loam
soil and tightly capped the tubes.

Hypersensitivity Reaction and Pathogenecity
Test
Approximately 108
-109
cfu/ml of freshly cultured
bacteria from YDC plates were injected with a
hypodermic syringe into the abaxial surface of
three sections/tobacco leaf of cultivar Virginia,
for routine hypersensitivity test. Inoculation was
done at 5-6 leaf stage. Sterile distilled water was
used as control. Complete collapse of tissue after
24 h followed by necrosis was recorded as
positive reaction (Klement and Goodman, 1967).
Fifteen isolates showing typical colony
characteristics and strong hypersensitivity
reaction were selected for further testing. Six rice
cultivars including 1RR1 6, KS-282. .JP 5,
Basmati 385, Dilrosh 97 and Kashmir Basmati
385 were used for pathogenecity test. Seedlings
of each cultivar were grown on moist sterilized
filter papers in Petri plates, maintained in a
growth chamber at .U) 30-35o
C (' (100% RH).
Two weeks old seedlings were transplanted lo
small plastic pots (diameter 13cm) containing
loamy soil and placed in green house. At pre-
tillering stage, plants were again transplanted to
bigger plastic pots (diameter 27 cm). These
cultivars were subjected to pathogenecity test
using pinprick and clip inoculation methods.
Pinprick method consisted of pricking three
leaves/cultivar with the inoculum loaded needle
(10 -108
cfu/ml) whereas during clip method, a
pair of sterile scissors was dipped in the
inoculum (107
-108
cfu/ml) and three leaves per
plant were cut with it approximately 2-3 cms
from the tip. Controls were treated with sterile
distilled water for both the methods. Inoculated
plants, wrapped in moist plastic bags were then
transferred to green house where bags were
removed after three days. Twelve to fourteen
days after inoculation, lesion sizes were
measured along both the leaf axes with a scale.
CRD three factorial test was used to determine
differences between the two inoculation methods
for each cultivar separately at 5% level of
probability. The effect of isolates on mean lesion
size was determined with CRD two factorial test.
Means showing significant difference were
separated by Least Significant Difference (LSD)
test.

Biochemical Characterization Tests
YDC cultures (24 hrs old) were used for the nine
biochemical tests. Gram staining (Gerhardt,
1981) consisted of subjecting a thin bacterial
film on a glass slide to aqueous Crystal Violet,
Iodine, Ethanol and Safranin solutions for
various periods of time and washing with tap

Kết quả (Việt) 1:

CÔ LẬP VÀ ĐẶC TÍNH CỦA XANTHOMONAS
ORYZAE PV. ORYZAE cô lập từ Bắc
WEST biên giới tỉnh (NWFP) PAKISTAN
trừu tượng
Xanthomonas oryzae pv. oryzae, các đại lý quan hệ nhân quả của vi khuẩn lá giống bọ xanh (BLB) của gạo được đặc trưng qua
pathogenecity và sinh hóa thử nghiệm. Các mẫu thực vật được thu thập từ khu vực lớn sinh thái nông lúa bao gồm
hạ Dir, Swat và trạm nghiên cứu nông nghiệp, Mingora ở NWFP trong năm 2002. Chủng thu được
chịu pathogenecity thử nghiệm trên sáu giống cây trồng lúa khác nhau đáng kể về mức độ nghiêm trọng của bệnh trong số mỗi
khác. Tuy nhiên, kết quả không đáng kể đã được ghi lại khi clip và ngây phương pháp tiêm phòng lá
đã so sánh cho bài kiểm tra pathogenecity. Các chủng cũng đã được chịu các xét nghiệm sinh hóa khác nhau và đã được tìm thấy
được tiêu cực cho phản ứng Oxidase, Lecithinase và Gram. Kết quả của các xét nghiệm sinh hóa thích Tween 80 và tinh bột
thủy phân, kỵ khí thiên nhiên và axit sản xuất từ carbohydrate khác nhau giữa các chủng. Chỉ 20% chủng
tương tự như trong điều khoản của phản ứng của họ để những thử nghiệm này. Dựa trên phản ứng sinh hóa nó được thành lập rằng mặc dù các
kích thước mẫu nhỏ (n = 15) biến đổi di truyền được tìm thấy trong Xathamonas oryzae pv. oryzue cô lập.
Gạo được trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới
của thế giới và là một thực phẩm chủ yếu cho khoảng 2,7
tỷ người trên toàn thế giới (Salim et al., 2003).
Gạo được xếp hạng thứ hai trong Pakistan về
khu vực nuôi trồng và sản xuất sau khi lúa mì
cây trồng (nông nghiệp thống kê của Pakistan, 2003-
năm 2004). Ngoài việc Pakistan của quan trọng
cây trồng, gạo cũng là một mặt hàng xuất khẩu chính và
đóng góp Rs. 36534.7 triệu đến quốc gia
exchequer trong naêm taøi khoùa 2003-2004
(nông nghiệp thống kê của Pakistan, 2003-2004).
Pakistan Super Basnuui và Kernal gạo
thế giới nổi tiếng nhất của hương thơm tiếp thêm sinh lực và
cây trồng lúa là dễ bị một số
bệnh trong đó vi khuẩn giống bọ xanh gạo
do Xanthomonas oryzae pv. oryzac
đu et al., 1990) đã là một quan trọng
hạn chế để sản xuất gạo ở Châu á (Lozano,
1981). Tại Pakistan, bệnh này đã được báo cáo đầu tiên
trong năm 1977 (Mew và Majid, 1977). Các
vi khuẩn có thể lây nhiễm gạo từ cây giống sân khấu để
trưởng thành thực vật và các bệnh được thể hiện bởi
'lá giống bọ xanh' hoặc 'kresek' triệu chứng. Trong
ông lá giống bọ xanh pha, quan hệ nhân quả sinh vật đi vào các
thực vật thông qua vết thương hoặc thông qua các lỗ chân lông nước
ocated trên rìa của trên một phần của các
gỗ, sản xuất tổn thương, có nước
ngâm, màu vàng với lợi nhuận bất thường, lượn sóng và
tiến xuống lá. Tổn thương thường
bắt đầu từ mép lá gần đỉnh của nó. Vi khuẩn
lông, bao gồm của nhỏ, màu vàng,
khối hình cầu, đôi khi có thể được nhìn thấy trên các
lợi nhuận hoặc tĩnh mạch của lá tươi bị nhiễm
trong điều kiện ẩm ướt. Mặt khác, các
Kresek giai đoạn là một giai đoạn hệ thống trong thời gian đó
héo cấp tính của các cây giống diễn ra. Điều này
triệu chứng thường xuất hiện một hoặc hai tuần sau khi
cấy. Lá rẽ hơi xám xanh, khô héo
đột nhiên và cuộn lên trên. Giai đoạn Kresek
lần đầu tiên được báo cáo từ Indonesia và sau đó
báo cáo xảy ra ở hầu hết gạo lớn
khu vực trong khu vực nhiệt đới (Reitsma và Sehure, 1950).
BLB dưới nhẹ nhiễm trùng gây ra năng suất giảm
khác nhau, từ 10-12% (Mew và ctv., 1993)
trong khi điều kiện nghiêm trọng, nó có thể cao
50% (Ou, 1985). Trong phay. Các hạt
từ blighted thực vật bị phá vỡ một cách dễ dàng. Các
mục đích của nghiên cứu này là để cô lập và
đặc trưng chủng khác nhau của các đại lý quan hệ nhân quả
từ NWFP bằng cách sử dụng pathogenecity bioassay và
xét nghiệm sinh hóa. Điều này dự kiến sẽ cung cấp
lần đầu tiên tay thông tin về các mầm bệnh và các
cơ sở dữ liệu do đó phát triển có thể được sử dụng trong
phát triển giống cây trồng với sức đề kháng bền
chống lại các mầm bệnh trong tương lai nghiên cứu.

Vật liệu và phương pháp
cô lập
chín mươi mẫu gạo ở các giai đoạn bắt đầu panicle,
triệu chứng điển hình giống bọ xanh vi khuẩn đang hiện đã
thu thập bao gồm tám mẫu từ
hạ Dir, 36 từ nghiên cứu nông nghiệp
Station, Mingora và 46 từ khu vực Swat
NWFP. Bệnh lá mảnh (2 x 7 mm)
bề mặt tiệt trùng với 1% Clorox và chuyển
để Petri tấm có chứa nấm men-Extract - Caleium-
trung bình agar cacbonat (YDC) bằng cách sử dụng ba
sao chép và ủ tại 25-27o
C cho 72 giờ
(Wilson et al. 1967). Vàng, mucoid, doom
hình thuộc địa với toàn bộ lợi nhuận phát triển
mà tiếp tục được nuôi cấy phụ. Nền văn hóa đã
bảo tồn cho thời gian lâu hơn (lúc 40
C) bởi
pipetting cách 0.5ml của một giải pháp tiêm chủng nặng nutrientbroth vào một ống của vô trùng, sandy-loam
đất và chặt chẽ mũ các ống.

Phản ứng quá mẫn và Pathogenecity
kiểm tra
khoảng 108
-109
cfu/ml của văn hóa tươi
vi khuẩn từ YDC tấm đã được tiêm với một
tiêm ống tiêm vào bề mặt xa trục của
ba phần/thuốc lá lá của cây trồng Virginia,
cho bài kiểm tra thường xuyên quá mẫn. Tiêm chủng là
thực hiện giai đoạn 5-6 lá. Vô trùng nước cất là
được sử dụng như kiểm soát. Sự sụp đổ của mô sau khi hoàn tất
24 h theo hoại tử đã được ghi là
phản ứng tích cực (Klement và Goodman, 1967).
Mười lăm cô lập đang hiện thuộc địa điển hình
đặc điểm và mạnh quá mẫn
phản ứng đã được lựa chọn để tiếp tục thử nghiệm. Sáu gạo
giống cây trồng bao gồm 1RR1 6, KS-282. .JP 5,
Basmati 385, Dilrosh 97 và Kashmir Basmati
385 đã được sử dụng cho thử nghiệm pathogenecity. Cây giống
của mỗi giống cây trồng được trồng trên ẩm tiệt trùng
giấy lọc trong Petri tấm, duy trì trong một
tăng trưởng phòng tại.U) 30-35o
C (' (100% RH).
hai tuần cũ cây giống được transplanted lo
nhỏ nhựa chậu (đường kính 13cm) chứa
loamy đất và được đặt trong nhà màu xanh lá cây. Tại pre-
tillering giai đoạn, nhà máy lại được cấy vào
chậu nhựa lớn (đường kính là 27 cm). Những
giống cây trồng đã phải chịu thử nghiệm pathogenecity
bằng cách sử dụng phương pháp tiêm phòng ngây và clip.
Ngây phương pháp bao gồm sự đâm ba
lá/giống với inoculum nạp kim
(10-108
CFU/ml) trong khi trong clip phương pháp, một
cây vô trùng kéo được nhúng trong các
inoculum (107
-108
cfu/ml) và ba lá mỗi
thực vật bị cắt với nó khoảng 2-3 cms
từ đầu. Điều khiển đã được điều trị với vô trùng
chưng cất nước cho cả hai phương pháp. Tiêm chủng
cây, gói trong túi nhựa ẩm sau đó
chuyển sang màu xanh lá cây nhà, túi ở đâu
gỡ bỏ sau khi ba ngày. Mười hai đến mười bốn
ngày sau khi tiêm chủng, kích thước tổn thương
đo dọc theo cả hai lá các trục với quy mô.
CRD ba thử nghiệm giai thừa đã được sử dụng để xác định
sự khác biệt giữa các phương pháp hai tiêm phòng
cho mỗi cây trồng một cách riêng biệt tại 5% mức độ
xác suất. Các hiệu ứng của chủng trên có nghĩa là tổn thương
kích thước đã được xác định với CRD hai thử nghiệm giai thừa.
Phương tiện Hiển thị quan trọng khác biệt
tách ra bởi sự khác biệt ít nhất đáng kể (LSD)
kiểm tra.

Sinh hóa đặc tính thử nghiệm
nền văn hóa YDC (24 giờ cũ) được sử dụng cho chín
xét nghiệm sinh hóa. Nhuộm gram (Gerhardt,
1981) bao gồm subjecting một vi khuẩn mỏng
phim trên một slide kính để dung dịch nước pha lê tím,
iốt, Ethanol và Safranin giải pháp cho
các thời kỳ khác nhau của thời gian và rửa với vòi nước

Kết quả (Việt) 2:

Cô lập VÀ TÍNH CHẤT CỦA Xanthomonas
oryzae pv. Oryzae phân lập từ NORTH
West Frontier Province (NWFP) PAKISTAN
TÓM TẮT
Xanthomonas oryzae pv. oryzae, các tác nhân gây cháy lá vi khuẩn (BLB) gạo được đặc trưng thông qua
pathogenecity và các xét nghiệm sinh hóa. Mẫu thực vật được thu thập từ các vùng lúa sinh thái nông nghiệp chính bao gồm
Lower Dir, Swat và Trạm nghiên cứu nông nghiệp, Mingora trong NWFP trong năm 2002 Các phân lập thu được đã
bị kiểm tra pathogenecity trên sáu giống lúa khác nhau đáng kể về mức độ nghiêm trọng của bệnh tật ở mỗi
khác . Tuy nhiên, kết quả không đáng kể được ghi nhận khi clip và pinprick phương pháp cấy lá
​​được so sánh để kiểm tra pathogenecity. Các phân lập cũng đã phải chịu xét nghiệm sinh hóa khác nhau và đã được tìm thấy
là tiêu cực đối Oxidase, Lecithinase và Gram phản ứng. Kết quả xét nghiệm sinh hóa như Tween 80 và tinh bột
thủy phân, kỵ khí tự nhiên và sản xuất axit từ Carbohydrates khác nhau giữa các chủng. Chỉ có 20% các mẫu phân lập
là tương tự nhau về phản ứng của họ với những bài kiểm tra. Dựa trên phản ứng sinh hóa nó được thành lập rằng mặc dù
cỡ mẫu nhỏ (n = 15) biến đổi di truyền đã được phát hiện trong Xathamonas oryzae pv. oryzue cô lập.
gạo được trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới
trên thế giới và là nguồn lương thực cho khoảng 2,7
tỷ người trên toàn thế giới (Salim et al., 2003).
gạo đứng thứ hai ở Pakistan về
diện tích canh tác và sản xuất sau lúa mì
cây trồng (Nông nghiệp Thống kê Pakistan, 2003-
2004). Ngoài việc quan trọng của Pakistan
cây trồng, gạo cũng là một mặt hàng xuất khẩu chủ lực và
đóng góp Rs. 36.534,7 triệu đến quốc gia
kho bạc trong năm tài chính 2003-2004
(Nông nghiệp Thống kê Pakistan, 2003-2004).
Siêu Basnuui và Kernal gạo của Pakistan là
nổi tiếng thế giới cho hương thơm tiếp thêm sinh lực và
Vụ thu hoạch lúa là dễ bị một số
bệnh trong đó các bệnh bạc lá vi khuẩn hại lúa
gây ra bởi Xanthomonas oryzae pv. oryzac
Swings et al., 1990) đã được một quan trọng
hạn chế để sản xuất lúa gạo ở châu Á (Lozano,
1981). Tại Pakistan, căn bệnh này đã được báo cáo đầu tiên
trong năm 1977 (Mew và Majid, 1977). Các
vi khuẩn có thể lây nhiễm gạo từ cây con giai đoạn để
trưởng thành thực vật và bệnh được biểu hiện bằng
một trong hai 'cháy lá hoặc các triệu chứng' kresek. Trong
giai đoạn ông lá bạc lá, sinh vật nhân quả đi vào
thực vật thông qua vết thương hoặc thông qua lỗ chân lông nước
ocated bên lề của phần trên của
mái hiên, tổn thương sản xuất, trong đó có nước
ngâm, màu vàng với không đều, biên độ gợn sóng và
tiến xuống những chiếc lá. Tổn thương thường
bắt đầu từ rìa lá gần đỉnh của nó. Vi khuẩn
lông, trong đó bao gồm nhỏ, màu vàng,
khối hình cầu, đôi khi có thể được nhìn thấy trên
lề hoặc tĩnh mạch của lá bị nhiễm tươi
trong điều kiện ẩm ướt. Mặt khác, các
giai đoạn Kresek là một giai đoạn mang tính hệ thống trong đó
héo cấp tính của cây diễn ra. Đây
triệu chứng thường xuất hiện một hoặc hai tuần sau khi
cấy. Lá chuyển sang màu xanh xám, khô héo
đột ngột và cuộn lên. Giai đoạn Kresek
lần đầu tiên được báo cáo từ Indonesia và sau đó đã được
báo cáo xảy ra ở hầu hết các trồng lúa
khu vực ở vùng nhiệt đới (Reitsma và Sehure, 1950).
BLB dưới nguyên nhân nhiễm trùng nhẹ năng suất giảm
từ 10-12% (Mew et al. , 1993)
trong khi đó theo tình trạng nghiêm trọng, nó có thể cao
đến 50% (Ou, 1985). Trong quá trình xay xát. Các hạt
từ cây tàn lụi có thể dễ dàng bị phá vỡ. Các
mục đích của nghiên cứu này là để cô lập và
mô tả đặc điểm chủng khác nhau của các tác nhân
từ NWFP sử dụng pathogenecity xét nghiệm sinh học và
xét nghiệm sinh hóa. Điều này sẽ cung cấp
thông tin tay đầu tiên trên mầm bệnh và các
cơ sở dữ liệu do đó phát triển có thể được sử dụng trong
việc phát triển giống cây trồng có khả năng chịu bền
chống lại mầm bệnh trong các nghiên cứu trong tương lai. Nguyên liệu và phương cách ly Chín mươi mẫu lúa ở giai đoạn bắt đầu bông, triệu chứng bạc lá vi khuẩn điển hình được thu thập bao gồm tám mẫu từ Lower Dir, từ 36 nghiên cứu nông nghiệp Station, Mingora và 46 từ các vùng Swat của NWFP. Miếng lá bị bệnh (2x7 mm) đã khử trùng bề mặt với 1% Clorox và chuyển đến đĩa Petri có chứa men-Extract-Caleium- cacbonat (YDC) môi trường thạch sử dụng ba lần nhắc lại, ủ ở 25 -27o C trong 72 giờ (Wilson et al. 1967). Màu vàng, chất nhầy, doom hình thuộc địa với toàn bộ lợi nhuận phát triển đó là thêm phụ nuôi. Nền văn hóa được bảo tồn cho thời gian dài hơn (ở 40 C) bằng cách trộn mẫu 0.5ml của một giải pháp nutrientbroth nặng cấy vào một ống vô trùng, cát-sét pha đất và giới hạn chặt chẽ các ống. Quá mẫn và phản ứng Pathogenecity thử nghiệm khoảng 108 -109 cfu / ml vừa nuôi cấy vi khuẩn từ tấm YDC được tiêm một ống tiêm dưới da vào bề mặt abaxial của ba phần / lá thuốc lá của cây trồng Virginia, cho kiểm tra thường xuyên quá mẫn. Tiêm phòng được thực hiện ở giai đoạn 5-6 lá. Nước cất vô trùng đã được sử dụng như kiểm soát. Toàn bộ sự sụp đổ của mô sau 24 giờ tiếp theo hoại tử được ghi nhận là phản ứng tích cực (Klement và Goodman, 1967). Mười lăm phân lập cho thấy quần thể điển hình đặc điểm và quá mẫn cảm mạnh mẽ phản ứng đã được lựa chọn để thử nghiệm thêm. Sáu lúa giống bao gồm 1RR1 6, KS-282. .jp 5, Basmati 385, Dilrosh 97 và Kashmir Basmati 385 được sử dụng để kiểm tra pathogenecity. Cây của mỗi giống được trồng trên tiệt trùng ẩm ướt giấy lọc trong đĩa Petri, duy trì trong một buồng tăng trưởng ở mẫu chữ âm) 30-35o C ('(100% RH). Hai tuần cây cũ đã được cấy ghép lo chậu nhựa nhỏ (đường kính 13cm) có chứa đất mùn và được đặt trong nhà kính. Tại trước giai đoạn đẻ nhánh, nhà máy đã một lần nữa cấy vào chậu nhựa lớn (đường kính 27 cm). Những giống đã phải chịu kiểm tra pathogenecity sử dụng pinprick và clip phương pháp tiêm chủng. Pinprick phương pháp bao gồm chích ba lá / giống với tác nhân gây bệnh nạp kim (10 -108 cfu / ml) trong khi phương pháp trong clip, một cây kéo vô trùng đã được nhúng trong tiêm chủng (107 -108 cfu / ml) và ba lá trên cây bị cắt với nó khoảng 2 3 cm từ đầu. điều khiển được điều trị bằng vô trùng nước cất cho cả hai phương pháp. tiêm chủng thực vật, được bọc trong túi nhựa ẩm sau đó được chuyển giao cho nhà kính mà túi đã được gỡ bỏ sau ba ngày. mười hai đến mười bốn ngày sau khi cấy, kích thước tổn thương là đo dọc theo hai trục lá có quy mô. CRD ba thử nghiệm nhân tố được sử dụng để xác định sự khác biệt giữa hai phương pháp tiêm chủng cho từng loại cây trồng riêng tại 5% của mức xác suất. Hiệu quả của việc phân lập trên tổn thương có nghĩa là kích thước được xác định với CRD hai thử nghiệm giai thừa. Phương thấy sự khác biệt đáng kể nào được ngăn cách bởi kém khác biệt đáng kể (LSD) thử nghiệm. Đặc tính sinh hóa thử nghiệm các nền văn hóa YDC (24 giờ tuổi) đã được sử dụng trong chín xét ​​nghiệm sinh hóa. Nhuộm Gram (Gerhardt, 1981) gồm có phải chịu một vi khuẩn mỏng phim trên một slide kính Crystal Violet, dung dịch i-ốt, Ethanol và Safranin giải pháp cho thời kỳ khác nhau của thời gian và rửa bằng vòi nước