Extraction Protocol: ChelexThis is

Extraction Protocol: Chelex
This is a fast, cheap, and effective method of DNA extraction. Because this is the first step
towards PCR and amplifying your template DNA, you must maintain excellent sterile technique
to prevent the contamination of your DNA extractions. Always use a negative chelex control
(below) to evaluate your technique during the extraction phase.
Work in LOW DNA part of lab.
1. Remove premade tubes filled with 300uL 10% Chelex
from refridgerator. You will need for each sample, plus 1
extra for a control. Handle the container with gloves and
shake out the number you need into your gloved hand. Do
not put extra tubes back into jar.
2. Label each Chelex tube to correspond to your sample
listed on your Chelex worksheet. Label the tubes on the
cap. Put as much information as you can manage, but
keep labels legible. Adding initials and a date is always a
good idea. Avoid labeling on the side of tube as this
writing can be washed off during the incubation stage.
3. Turn on heating block. Set to 95°C. Fill holes with
ddH2O water.
4. Dip forceps into ethanol, then wave forceps through flame
of an alcohol burner to ignite. When you are certain that
the flame on the forceps has extinguished, repeat 2 times.
5. Using the sterile forceps, remove a small piece of tissue
from your sample, uncap the tube of chelex, place sample
in the appropriately labeled tube and close lid. The piece
of tissue should be big enough to be visible, but not so big
as to be easily visible. Imagine cutting a 0.2mm section of
a standard staple. This is plenty big. Too much tissue may
inhibit your reactions. The piece of tissue should be about
as big as a period
.
6. Repeat (step 5) with each sample in a new Chelex tube, being sure to sterilize forceps 3
times between samples (step 4). When finished, make a negative Chelex control by
dipping your sterilized forceps into a tube of Chelex slurry. (It may be necessary to wipe
excess tissue from forceps with a kimwipe prior to flame sterilization)
7. When finished with all tubes, vortex samples in chelex
slurry for 10-15 seconds. Be sure lids are snapped on
tightly before begining
8. Spin samples briefly (10-15 sec) at high speed in a
microcentrifuge. This step is to ensure that the sample is
inside the slurry of Chelex.
9. Incubate samples for 20 minutes at 95°C. The block
temperature may drop slightly when doing this step. This
drop is normal. Check tubes while incubating to ensure
that lids have not popped off.
10. Vortex samples again for 10-15 seconds (Be careful as
steam may pop lid off of centrifuge tube. Hold lids
down).
11. Spin tubes again at high speed in microcentrifuge to
ensure that all contents are in the bottom of the
microcentrifuge tube.
12. Samples are ready to use (or not, see below). ONLY
USE SUPERNATE FOR PCR REACTIONS.
CHELEX BEAD WILL INACTIVATE TAQ!
Notes:
Chelex is notorious for being as fickle as it is cheap and easy. Here are some tips for good
amplifications:
1. Sometimes samples work best if used immediately. Sometimes it is better to wait
overnight before using them. Experiment and find what works for your species. Results
can vary by taxa and by individuals.
2. When doing initial PCRs, do a serial dilution of template. The amount of a Chelex DNA
extraction used in a PCR can be as high as half of the volume of the PCR or as low as 1
microliter of a 1:10,000 dilution. I find that 1 microliter of a 1:1 is good for most
applications, but if your PCR doesn’t work initially, vary template concentration.
]Supernate
] Chelex
3. If you don't get amplifications from your PCR the first time with a Chelex extract, repeat
the vortex, spin, incubate, vortex, spin, sit overnight procedure described above. Often
this will make a negative PCR work. Don’t ask me why…

Kết quả (Việt) 2:

Extraction Protocol: Chelex
Đây là một phương pháp nhanh chóng, giá rẻ, và hiệu quả của chiết DNA. Bởi vì đây là bước đầu tiên
hướng tới PCR và khuyếch đại DNA mẫu của bạn, bạn phải duy trì kỹ thuật khử trùng tuyệt vời
để ngăn chặn sự ô nhiễm của nhổ DNA của bạn. Luôn luôn sử dụng một điều khiển chelex tiêu cực
(bên dưới) để đánh giá kỹ thuật của bạn trong giai đoạn khai thác.
Làm việc trong một phần DNA LOW của phòng thí nghiệm.
1. Tháo ống premade đầy 300uL 10% Chelex
từ Tủ lạnh. Bạn sẽ cần cho mỗi mẫu, cộng với 1
phụ cho một điều khiển. Xử lý các container với găng tay và
lắc ra số bạn cần vào bàn tay đeo găng của bạn. Do
không đặt ống phụ trở lại bình.
2. Dán nhãn cho mỗi ống Chelex để tương ứng với mẫu của bạn
được liệt kê trên bảng Chelex của bạn. Ghi nhãn trên ống trên
nắp. Đặt càng nhiều thông tin bạn có thể quản lý, nhưng
giữ cho nhãn dễ đọc. Thêm chữ cái đầu và một ngày luôn luôn là một
ý tưởng tốt. Tránh ghi nhãn về phía ống như này
viết có thể được rửa sạch trong giai đoạn ủ bệnh.
3. Bật khối gia nhiệt. Đặt đến 95 ° C. Điền vào lỗ với
nước ddH2O.
4. Kẹp Dip thành ethanol, sau đó vẫy kẹp qua ngọn lửa
của một ổ rượu để đốt cháy. Khi bạn chắc chắn rằng
ngọn lửa trên chiếc kẹp đã được dập tắt, lặp lại 2 lần.
5. Sử dụng kẹp vô trùng, loại bỏ một mẩu mô nhỏ
từ mẫu của bạn, dỡ nón ra các ống của chelex, mẫu diễn ra
trong ống ghi nhãn phù hợp và đóng nắp. Các mảnh
mô nên là đủ để được nhìn thấy lớn, nhưng không quá lớn
đến mức không thể dễ dàng nhìn thấy được. Hãy tưởng tượng việc cắt một phần 0.2mm của
một yếu tiêu chuẩn. Điều này là khá lớn. Quá nhiều mô có thể
ức chế phản ứng của bạn. Các mảnh mô nên được khoảng
lớn như một khoảng thời gian
.
6. Lặp lại (bước 5) với mỗi mẫu trong một ống Chelex mới, đang được bảo đảm để khử trùng kẹp 3
lần giữa các mẫu (bước 4). Khi hoàn thành, làm một điều khiển Chelex tiêu cực bằng cách
ngâm kẹp tiệt trùng của bạn vào một ống Chelex bùn. (Nó có thể là cần thiết để lau
mô thừa từ kẹp với một kimwipe trước khi ngọn lửa khử trùng)
7. Khi hoàn tất với tất cả các ống, mẫu xoáy trong chelex
bùn trong khoảng 10-15 giây. Hãy chắc chắn nắp được chụp vào
thật chặt trước khi khởi điểm
8. Mẫu quay một thời gian ngắn (10-15 giây) ở tốc độ cao trong một
microcentrifuge. Bước này là để đảm bảo rằng mẫu là
bên trong bùn của Chelex.
9. Ủ mẫu cho 20 phút ở 95 ° C. Khối
nhiệt độ có thể giảm nhẹ khi làm bước này. Điều này
giảm là bình thường. Kiểm tra ống trong khi ấp để đảm bảo
rằng nắp đã không xuất hiện ra.
10. Mẫu Vortex lại trong khoảng 10-15 giây (Hãy cẩn thận như
hơi nước có thể bật nắp ra của ống ly tâm. Giữ nắp
xuống).
11. Quay ống lại với tốc độ cao trong microcentrifuge để
đảm bảo rằng tất cả các nội dung là ở dưới cùng của
ống microcentrifuge.
12. Các mẫu đã sẵn sàng để sử dụng (hoặc không, xem bên dưới). CHỈ
SỬ DỤNG CHO SUPERNATE TÁC PCR.
CHELEX BEAD SẼ bất hoạt Taq!
Ghi chú:
Chelex là nổi tiếng vì là hay thay đổi vì nó là giá rẻ và dễ dàng. Dưới đây là một số lời khuyên cho tốt
khuyếch đại:
1. Đôi khi mẫu làm việc tốt nhất nếu được sử dụng ngay lập tức. Đôi khi nó là tốt hơn để chờ đợi
qua đêm trước khi sử dụng chúng. Thử nghiệm và tìm thấy những gì làm việc cho các loài của bạn. Kết quả
có thể khác nhau tùy theo loài và của cá nhân.
2. Khi làm PCR ban đầu, làm một pha loãng của mẫu. Số tiền của một Chelex DNA
chiết xuất được sử dụng trong một PCR có thể cao như là một nửa khối lượng của PCR hoặc thấp như 1
đo vi của một 1: pha loãng 10.000. Tôi thấy rằng 1 microliter của 1: 1 là tốt cho hầu hết
các ứng dụng, nhưng nếu PCR của bạn không làm việc ban đầu, thay đổi nồng độ mẫu.
] Supernate
] Chelex
3. Nếu bạn không nhận được khuyếch đại PCR của bạn từ lần đầu tiên với một chiết xuất Chelex, lặp lại
các xoáy, spin, ủ, xoáy, spin, ngồi thủ tục qua đêm được mô tả ở trên. Thường thì
điều này sẽ làm cho một tác phẩm PCR âm tính. Đừng hỏi tôi tại sao ...