The following method is effective i

The following method is effective in extracting DNA from small numbers (~10+) of partially purified oocysts, and is used in the author’s laboratory (22–24). Partially purified oocysts are suspended in 100 µl of lysis buffer (50 mM Tris/HCl, pH 8.5, 1 mM ethylene diamine tetra-acetic acid, pH 8, 0.5% sodium dodecyl sulphate [SDS], SigmaAldrich) and subjected to 15 freeze–thaw cycles (1 minute in liquid nitrogen; 1 minute 65°C). Samples are then transferred to a 55°C water bath, proteinase K (at a final concentration of 200 µg/ml) is added, and the samples are incubated for 3 hours. Proteinase K is heat denatured (90°C, 20 minutes), samples are chilled on ice for 1 minute, centrifuged (16,000 g, 5 minutes) then 70 µl of supernatant is removed for PCR amplification. SDS is inhibitory to Taq polymerase at concentrations as low as 0.01%, therefore, neutralisation of SDS in the extracted DNA is necessary. The addition of 2% Tween 20 will neutralise up to 0.05% SDS.
Reagents for PCR reactions are dispensed in 0.5 ml thin-walled tubes. Each tube contains 90 µl of pre-mixed reagents (200 µM of each of the four dNTPs, 200 nM each of primers CPB-DIAGR and CPB-DIAGF, bovine serum albumin at a final concentration of 400 µg/ml, MgCl2 at 3.5 mM, 2.5 U of Taq polymerase in PCR buffer and Tween 20 at a final concentration of 2% to inactivate 0.05% SDS). Finally, 10 µl of DNA template is introduced below approximately 40 µl of mineral oil. Samples are subjected to 39 amplification cycles, and products are visualised following ethidium bromide staining of 1.4% agarose gels (24).
The primers and step cycle protocols for amplifying either 18S rRNA gene fragment (24, 45, 46) or the COWP gene fragment (15) are given in Table 6

Kết quả (Việt) 1:

Các phương pháp sau đây có hiệu quả trong chiết DNA từ số lượng nhỏ (~ 10 +) của một phần tinh khiết oocysts, và được sử dụng trong phòng thí nghiệm của tác giả (22-24). Oocysts một phần tinh khiết được treo trong 100 ml lysis đệm (50 mM Tris/HCl, pH 8.5, 1 mM ethylene diamine axetic tetra axit, pH 8, 0,5% natri dodecyl sulphate [SDS], SigmaAldrich) và chịu các chu kỳ đóng băng-tan băng 15 (1 phút trong nitơ lỏng; 1 phút 65° C). Mẫu sau đó được chuyển sang tắm nước 55° C, proteinase K (ở nồng độ cuối cùng của 200 µg/ml) sẽ được thêm vào, và các mẫu được ủ cho 3 giờ. Proteinase K là nhiệt denatured (90° C, 20 phút), mẫu được ướp lạnh trên băng trong 1 phút, ly (16.000 g, 5 phút), sau đó 70 ml supernatant bị loại bỏ để khuếch đại PCR. SDS là ức chế polymerase Taq ở nồng độ thấp nhất là 0,01%, do đó, neutralisation SDS trong DNA được giải nén là cần thiết. Thành phố này có bổ sung thêm 2% giữa 20 sẽ neutralise lên để dùng mũi SDS 0,05%. Hoá chất cho phản ứng PCR được phân phát ở cách 0.5 ml mỏng-tường ống. Mỗi ống chứa 90 ml thuốc thử trước hỗn hợp (200 μm của mỗi người trong số bốn dNTPs, 200 nM mỗi lớp lót CPB-DIAGR và CPB-DIAGF, bò huyết thanh albumin lúc nồng độ cuối cùng của 400 µg/ml, MgCl2 3,5 mM, 2.5 U Taq polymerase trong PCR đệm và Tween 20 tại cuối cùng nồng độ 2% để hủy kích hoạt 0,05% SDS). Cuối cùng, 10 ml mẫu ADN được giới thiệu dưới đây khoảng 40 ml dầu khoáng sản. Mẫu được chịu các 39 khuếch đại chu kỳ, và các sản phẩm được visualised sau ethidium bromua nhuộm gel agarose 1,4% (24). Chất nền, mồi và bước chu kỳ giao thức để khuyếch đại hoặc 18S rRNA gene mảnh (24, 45, 46) hoặc đoạn gen COWP (15) được đưa ra trong bảng 6

Kết quả (Việt) 2:

Các phương pháp sau đây là hiệu quả trong việc chiết xuất DNA từ số nhỏ (~ 10 +) của oocyst phần tinh khiết, và được sử dụng trong phòng thí nghiệm của tác giả (22-24). Nhiều kén hợp tinh khiết đang lơ lửng trong 100 ml đệm ly giải (50 mM Tris / HCl, pH 8.5, 1 mM ethylene diamine tetra-axit axetic, pH 8, 0.5% sodium dodecyl sulfat [SDS], Sigma-Aldrich) và phải chịu 15 đá-lạnh chu kỳ tan băng (1 phút trong nitơ lỏng; 1 phút 65 ° C). Các mẫu này sau đó được chuyển giao cho một cốc nước C 55 °, proteinase K (ở nồng độ cuối cùng của 200 mcg / ml) được thêm vào, và các mẫu được ủ trong 3 giờ. Proteinase K là nhiệt biến tính (90 ° C, 20 phút), mẫu được ướp lạnh trên băng trong 1 phút, ly tâm (16.000 g, 5 phút) sau đó 70 ml nổi được lấy ra để khuếch đại PCR. SDS là ức chế Taq polymerase ở nồng độ thấp là 0,01%, do đó, trung hòa SDS trong DNA chiết xuất là cần thiết. Việc bổ sung 2% Tween 20 sẽ trung hòa đến 0,05% SDS.
Thuốc thử cho phản ứng PCR được phân phát trong 0,5 ml ống thành mỏng. Mỗi ống có chứa 90 ml thuốc thử trước hỗn hợp (200 mM của mỗi trong bốn dNTP, 200 nM mỗi mồi CPB-DIAGR và CPB-DIAGF, albumin huyết thanh bò ở nồng độ cuối cùng của 400 microgam / ml, MgCl2 3,5 mM , 2,5 U của Taq polymerase trong đệm PCR và Tween 20 ở nồng độ cuối cùng là 2% để vô 0,05% SDS). Cuối cùng, 10 ml mẫu DNA được giới thiệu dưới đây khoảng 40 ml dầu khoáng. Các mẫu được chịu đến 39 chu kỳ khuếch đại, và các sản phẩm được hình sau nhuộm bromide ethidium 1,4% agarose gel (24).
Các mồi và các giao thức chu kỳ bước để khuếch đại một trong hai đoạn 18S rRNA gene (24, 45, 46) hoặc các đoạn gen COWP (15) được cho trong bảng 6