RESULTSIn silico analyses.Despite t

RESULTS

In silico analyses.Despite the numerous criteria we wished to meet and the short regions available for primer location, we were able to design improved primers targeting the fungal 5.8S and 5′ LSU for amplicon-based Illumina community profiling, as depicted in Fig. 1. Visual inspection of the 5.8S and LSU alignments suggested that the new primer 5.8S-Fun would have wider coverage across Fungi yet stronger selectivity, particularly against plants, than existing primers, including ITS3 (49, 66) and fITS9 (27). Detailed taxonomic analyses with PrimerProspector support these expectations (Fig. 2; see also Fig. S3 in the supplemental material). For example, fITS9 will theoretically amplify all Viridiplantae, as well as various algal and protist lineages (Fig. 2). In contrast, 5.8S-Fun is a poor match to the analyzed Viridiplantae and most eukaryote sequences. We did not specifically evaluate fITS7, because this primer has been noted to exclude certain Ascomycota (Penicillium, Orbiliales), most Mucorales (27), and is a poor match to many Glomeromycota (E. A. Lilleskov, unpublished data). PrimerProspector analyses reveal high coverage of 5.8S-Fun across nearly all orders of Fungi available in the large UNITE database (see Fig. S3 in the supplemental material). fITS9 also has wide coverage at the level of fungal order, although a few groups exhibit lower coverage than 5.8S-Fun (see Fig. S3). We note that fITS9 also has strong secondary structure that may decrease amplification efficiency. ITS4 is commonly used in fungal studies (27, 38) but was not designed to be fungus selective (49). By moving the primer upstream 6 bases, we were able to access a site that remains highly conserved across Fungi but differs from plants. These observations are supported by PrimerProspector analyses using the Silva large subunit database: ITS4-Fun had nearly 100% coverage for Fungi but lower coverage for some other lineages, particularly Viridiplantae.

Kết quả (Việt) 1:

KẾT QUẢTrong các phân tích silico. Mặc dù các tiêu chuẩn rất nhiều chúng tôi muốn gặp gỡ và khu vực ngắn có sẵn cho các vị trí mồi, chúng tôi đã có thể thiết kế được cải tiến chất mồi nhắm mục tiêu 5.8S nấm và 5 ' LSU cho cộng đồng dựa trên amplicon Illumina profiling, như mô tả trong hình 1. Kiểm tra trực quan của 5.8S và sự sắp xếp LSU gợi ý rằng mới mồi 5.8S-niềm vui sẽ có phạm vi bảo hiểm rộng hơn trên nấm chưa chọn lọc mạnh mẽ hơn, đặc biệt là đối với cây trồng, so với lớp lót sẵn có, bao gồm ITS3 (49, 66) và fITS9 (27). Phân tích phân loại chi tiết với PrimerProspector hỗ trợ những kỳ vọng (hình 2; Xem thêm hình. S3 trong các tài liệu bổ sung). Ví dụ: fITS9 sẽ về lý thuyết khuếch đại tất cả Viridiplantae, cũng như nhiều tảo và dòng dõi protist (hình 2). Ngược lại, 5.8S-niềm vui là một trận đấu kém Viridiplantae phân tích và hầu hết eukaryote trình tự. Chúng tôi đã không đặc biệt đánh giá fITS7, bởi vì mồi này đã được ghi nhận để loại trừ một số Ascomycota (Penicillium, Orbiliales), hầu hết Mucorales (27), và phù hợp với người nghèo để nhiều Glomeromycota (E. A. Lilleskov, dữ liệu chưa được công bố). PrimerProspector phân tích cho thấy phạm vi bảo hiểm cao của 5.8S-niềm vui trên gần như tất cả các đơn đặt hàng của nấm có sẵn trong cơ sở dữ liệu lớn UNITE (xem hình. S3 trong các tài liệu bổ sung). fITS9 cũng có phạm vi bảo hiểm rộng ở cấp độ của nấm, mặc dù một vài nhóm triển lãm các bảo hiểm thấp hơn 5.8S-vui vẻ (xem hình. S3). Chúng tôi lưu ý rằng fITS9 cũng có cấu trúc bậc hai mạnh có thể làm giảm khuếch đại hiệu quả. ITS4 thường được sử dụng trong các nghiên cứu nấm (27, 38) nhưng không được thiết kế để là nấm chọn lọc (49). Bằng cách di chuyển các mồi thượng lưu 6 căn cứ, chúng tôi đã có thể truy cập một trang web đó vẫn bảo tồn cao trên nấm nhưng khác từ thực vật. Những quan sát này được hỗ trợ bởi PrimerProspector phân tích bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu lớn tiểu đơn vị của Silva: ITS4 vui vẻ đã có gần 100% bảo hiểm cho nấm nhưng phạm vi bảo hiểm thấp hơn cho một số dòng dõi khác, đặc biệt là Viridiplantae.

Kết quả (Việt) 3:

Kết quả.{ cH00FFFF} trong phân tích. Mặc dù có rất nhiều tiêu chuẩn, chúng tôi hy vọng được gặp mồi ngắn cho vị trí của khu vực, chúng ta có thể cải tiến thiết kế mồi nấm và khuếch đại 5.8S cho 5 'LSU dựa trên biểu đồ phân tích Illumina của xã hội, như những sê - 1.Kiểm tra thị lực của LSU 5.8S và tuyến đường mới sẽ rộng bao phủ 5.8s-fun khuyên mồi ở nấm có chọn lọc trong, đặc biệt là với cây cối, hơn hết mồi, bao gồm its3 (49, 66) và (27) fits9.Phân loại phân tích chi tiết với primerprospector ủng hộ những mong đợi (hình 2; xem bản đồ bổ sung S3 trong vật liệu).Ví dụ, giả thuyết fits9 giới phóng to, và nhiều loại cây phả hệ của tảo và động vật nguyên sinh (số 2).Thay vào đó, 5.8s-fun giới phân tích là không phù hợp, hầu hết các sinh vật nhân chuẩn sequence.Chúng ta không có đánh giá cụ thể fits7, bởi vì cuốn sách đã chú ý tới loại trừ một số Ascomycota (Penicillium, orbiliales), hầu hết (27), là một trong nhiều buộc không khớp (E. A. Lilleskov, unpublished data).Phân tích primerprospector tiết lộ cao tỷ lệ bao phủ, trong hầu hết các mệnh lệnh được 5.8s-fun nấm trong cơ sở dữ liệu thống nhất lớn (ở vật liệu bổ sung S3).Fits9 vẫn có diện tích che phủ Quảng loại nấm trong trật tự cấp, mặc dù một vài nhóm thể hiện tỷ lệ bao phủ thấp hơn 5.8s-fun ( 3).Chúng ta chú ý đến, fits9 còn có hai cấu trúc rất mạnh, có thể làm giảm khả năng khuếch đại. là nấm thường nghiên cứu (27, 38) nhưng không áp dụng được vi khuẩn có chọn lọc (49).Di chuyển qua những đoạn mồi thượng nguồn căn cứ 6 người, chúng ta có thể truy cập vào một trang web, vẫn giữ ở độ cao, nấm, nhưng khác với thực vật.Những kết quả này đều hỗ trợ sử dụng cơ sở dữ liệu phân tích primerprospector Silva kê: ITS4 vui có gần hết bao gồm nấm nhưng thấp hơn bao gồm cây phả hệ khác, đặc biệt là giới hạn.