DNA isolationTo amplify theS-RNasea

DNA isolation
To amplify the
S
-
RNase
alleles, total genomic DNA
was isolated from young leaves of each plant accord-
ing to Dellaporta et al. (1983).
Primers design
The aim of this procedure was to design primers with
high probability of amplifying every
S
-
RNase
alleles
of
Solanum.
To this end, primers were designed on the
basis of conserved regions (Fig. 2a) defined by the
alignment of
S
-
RNase
nucleotide sequences from
Solanum
[
Sc
—
S2
,
S3
,
S11
,
S12
,
S13
and
S14
(DDBJ/
EMBL/GenBank X56896, X56897, S69589, AF191
1732, L36667 and AF232304, respectively), and St—
S2
(DDBJ/EMBL/GenBank X62727)].
The couple of primers designed on the basis of
C2 and C3 alignment were not degenerate (Table 3)
because C2 and C3 showed very high amino acid
sequence
similarity
among
the
S
-
RNase
alleles.
Conversely,
since
the
alignment
of
C1
and
C4
exhibited
lower
amino
acid
sequence
similarity
among the
S
-
RNase
alleles, primers designed on the
basis of these conserved regions were degenerate
(Table 3).
Nested PCR assays
Two steps of PCR amplification were performed in
nested PCR assays. C1FD and C4RD primers were
used in the first round of PCR amplification. Each
25
l
l reaction mixture contained 0.5
l
M of each
primer,
20
0
l
M
dNTP
mix,
4
mM
MgCl ,10
2
9
PCR
buffer,
2
U
Taq
polymerase
(Invitrogen,
Carlsbad,
CA,
USA)
and
150
ng
of
DNA
as
template. The PCR program consisted of 1 cycle
at 94
_
C for 2 min; 35 cycles at 94
_
C for 30 s,
Table 1
Argentinean accessions of
S.
chacoense
,
S.
spegazzinii
and
S.
kurtzianum
Species
Accession
a
Collection site
b
Plants used in this experiment
c
S.
chacoense
PI458314
Catamarca, Poman, 28
´
_
18
0
S–66
_
09
0
W, 1,700 m
5
(P1–P5), P3 carries
S11
-
RNase
allele
QBCM
Buenos Aires, Balcarce, 38
_
00
0
S–57
_
49
0
W, 140 m
1
3
(Q1–Q13), Q1 carries
S16
-
RNase
allele
S.
spegazzinii
OL4916
Salta, Cuesta del Obispo, 25
_
10
0
S–65
_
52
0
W, 3,300 m
5
(O1–O5)
OKA5649
Salta, Cuesta del Obispo, 25
_
10
0
S–65
_
52
0
W, 3,000 m
5
(O6–O10)
S.
kurtzianum
OKA6003
La Rioja, Sierra de Ambato, 28
Æ
45
0
S–66
_
24
0
W, 1,000 m
5
(K1–K5)
CIM872
Mendoza, Estancia La Cumbre, 34
_
10
0
S–69
_
14
0
W, 1,440 m
5
(K6–K10)
a
Collector and collection numbers; collectors:
Oka
Okada;
OL
Okada, Lucarini;
CIM
Clausen, Masuelli;
QBCM
Bedogni, Camadro,
Marcellan
´
b
Province, location, coordinates, altitude
c
Number, reference name in brackets and
S
-
RNase
alleles confirmed in these plants (Marcellan et al. 2006)
´
Euphytica (2012) 187:19–29
21
123



55
_
C for 1 min, and 72
_
C for 1 min, and 1 cycle
at 72
_
C for 10 min. Combinations of C2F–C4RD
or
C2F–C3R
primers
were
used
to
perform
the
second
round
of
PCR
amplification.
Each
25
l
l
reaction mixture contained 5
l
l of reaction product
from the first round of PCR, 200
l
M dNTP mix,
4
mM MgCl ,10
2
9
PCR buffer, 2 U Taq polymer-
ase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and 0.5
l
M
of each primer. The PCR program was similar to
the first round of PCR except for the annealing
temperature
(60
_
C).
Amplified
products
of
each
plant were separated on 2 % TAE agarose gels,
stained with Sybr Safe and visualized with a blue-
light transilluminator.
SSCP analyses
PCR products obtained with C2F and C3R nested
primers were extracted using E-Gel
_
CloneWell
TM
SYBR Safe Gels and E-Gel
_
IBase
˙
TM
Power System
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). For SSCP analysis
5
l
l of each PCR fragment were added to 9
l
lof
denaturing solution [95 % (v/v) formamide, 0.05 %
(w/v) xylene cyanol, 0.05 % bromophenol blue, and
0.01
M NaOH], heated at 94
_
C for 4 min. and then
chilled on ice. The samples were loaded on 16
9
14
cm gel using a 0.5
9
MDE
TM
(Mutation Detection
Enhancement) gel solution (Cambrex Bio Science
Rockland Inc, USA) and were electrophoresed for 2 h
Table 2
Results of pollen–pistil compatibility relationships in crosses within and between QBCM and PI458314 accessions
obtained by fluorescence microscopy
Female parent
Male parent
QBCM
PI458314
Q1
(
S16
)
Q2
Q3
Q4
Q5
Q6
Q7
Q8
Q9
Q10
Q11
Q12
Q13
P1
P2
P3
(
S11
)
P4
P5
QBCM
Q1 (
S16
)I
a
C
b
CC
C
C
C
C
C
C
C
Q2
I
C
C
C
Q3
C
C
C
C
C
C
Q4
C
C
I
C
C
Q5
C
I
C
Q6
C
C
I
C
Q7
C
C
C
C
C
C
Q8
C
C
C
I
Q9
C
C
I
Q10
C
C
I
I
Q11
I
C
I
I
I
C
C
Q12
C
I
Q13
C
I
C
I
I
I
PI458314
P1
C
C
IC
IC
P2
C
C
I
P3 (
S11
)C
C
C
C
C
C
I
C
P4
C
C
C
I
I
C
P5
C
C
I
C
C
C
C
Each plant (heterozygous genotype) was identified with a letter and a number (reference name). The plants Q1 and P3 carry
S16
-
and
S11
-
RNase
alleles, respectively. The number of genotypic combinations performed for each combination of plants was determined by
the synchrony of flowering and the number of flowers available per parental plant
a
Incompatible relationship: inhibition of growth of pollen tubes in the style. It could be visualized in Fig. 1b
b
Compatible relationship: normal growth of pollen tubes along pistil. It could be visualized in Fig. 1a
22
Euphytica (2012) 187:19–29
123

Kết quả (Việt) 2:

Cô lập DNA
Để khuếch đại
S
-
RNase
alen, tổng DNA của bộ gen
đã được phân lập từ lá non của mỗi nhà máy accord-
ing để Dellaporta et al. . (1983)
Sơn lót thiết kế
Mục đích của thủ tục này là để thiết kế mồi với
xác suất cao của khuếch đại mỗi
S
-
RNase
alen
của. Solanum Để kết thúc này, các mồi được thiết kế trên cơ sở các vùng bảo tồn (Hình 2a). De fi được xác định bởi các liên kết của S - RNase nucleotide trình tự từ Solanum [Sc - S2, S3, S11, S12, S13 và S14 (DDBJ / EMBL / GenBank X56896, X56897, S69589, AF191 1732, L36667 và AF232304, tương ứng), và St- S2 (DDBJ / EMBL / GenBank X62727)]. Các cặp vợ chồng của cặp mồi được thiết kế trên cơ sở của C2 và C3 chỉnh được không thoái hóa (Bảng 3) vì C2 và C3 cho thấy amin rất cao các S - RNase alen, sơn lót được thiết kế trên cơ sở của các vùng bảo tồn là thoái hóa. (Bảng 3) Nested PCR xét nghiệm Hai bước của PCR ampli fi cation đã được thực hiện trong các xét nghiệm PCR lồng nhau. C1FD và C4RD mồi được sử dụng trong vòng fi đầu tiên của PCR ampli fi cation. Mỗi 25 l hỗn hợp l phản ứng chứa 0,5 l M của mỗi lớp sơn lót, 20 0 l M dNTP sẽ mix, 4 mM MgCl, 10 2 9 PCR đệm, 2 U Taq polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) và 150 ng của DNA như bản mẫu. Các chương trình PCR gồm 1 chu kỳ 94 _ C trong 2 phút; 35 chu kỳ với 94 _ C trong 30 s, Bảng 1 đan có Argentina của S. chacoense, S. spegazzinii và S. kurtzianum loài gia nhập một trang web Collection b Cây được sử dụng trong thí nghiệm này c S. chacoense PI458314 Catamarca, Poman, 28 '_ 18 0 S-66 _ 09 0 W, 1.700 m 5 (P1-P5), P3 mang S11 - RNase alen QBCM Buenos Aires, Balcarce, 38 _ 00 0 S-57 _ 49 0 W, 140 m 1 3 (Q1-Q13 ), Q1 mang S16 - RNase alen S. spegazzinii OL4916 Salta, Cuesta del Obispo, 25 _ 10 0 S-65 _ 52 0 W, 3.300 m 5 (O1-O5) OKA5649 Salta, Cuesta del Obispo, 25 _ 10 0 S -65 _ 52 0 W, 3.000 m 5 (O6-O10) S. kurtzianum OKA6003 La Rioja, Sierra de Ambato, 28 Æ 45 0 S-66 _ 24 0 W, 1.000 m 5 (K1-K5) CIM872 Mendoza, Estancia La Cumbre, 34 _ 10 0 S-69 _ 14 0 W, 1.440 m 5 (K6-K10) một Collector và thu thập số; thu: Oka Okada; CV Okada, Lucarini; CIM Clausen, Masuelli; QBCM Bedogni, Camadro, Marcellan 'b tỉnh, vị trí, tọa độ, độ cao c Số lượng, tên tài liệu tham khảo trong ngoặc và S - RNase alen con fi rmed trong các nhà máy (Marcellan et al . 2006) 'Euphytica (2012) 187: 19-29 21 123 55 _ C trong 1 phút, và 72 _ C trong 1 phút, và 1 chu kỳ 72 _ C trong 10 phút. Sự kết hợp của C2F-C4RD hoặc C2F-C3R mồi đã được sử dụng để thực hiện các thứ hai vòng của PCR ampli fi cation. Mỗi 25 l l hỗn hợp phản ứng chứa 5 l l của sản phẩm phản ứng từ vòng đầu tiên kinh của PCR, 200 l M dNTP sẽ mix, 4 mM MgCl , 10 2 9 đệm PCR, 2 U Taq polymer- ase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) và 0,5 l M của mỗi mồi. Các chương trình PCR là tương tự như vòng fi đầu tiên của PCR trừ cho ủ nhiệt độ (60 _ C). Ampli fi ed sản phẩm của mỗi nhà máy được tách ra trên 2% TAE gel agarose, nhuộm với Sybr Safe và hình tượng với một blue-ánh sáng transilluminator. SSCP phân tích sản phẩm PCR thu được với C2F và C3R lồng mồi được trích xuất bằng E-Gel _ CloneWell TM SYBR Safe Gel và E-Gel _ Ibase ˙ TM Power System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Đối với SSCP phân tích 5 l l của từng mảnh vỡ PCR đã được thêm vào 9 l lof giải pháp biến tính [95% (v / v) formamid, 0,05% (w / v) xylene cyanol, 0,05% bromophenol màu xanh, và 0,01 M NaOH], sưởi nóng 94 _ C trong 4 phút. và sau đó ướp lạnh trên băng. Các mẫu được nạp trên 16 9 14 cm gel sử dụng một 0,5 9 MDE TM (Phát hiện đột biến Enhancement) giải pháp gel (Cambrex Bio Science Rockland Inc, Mỹ) và được electrophoresed cho 2 h Bảng 2 Kết quả của mối quan hệ tương thích phấn hoa nhụy hoa trong thập trong vòng và giữa QBCM và PI458314 đan có thu được bằng kính hiển vi fl uorescence Nữ mẹ Nam mẹ QBCM PI458314 Q1 (S16) Q2 Q3 Q4 Q5 Q6 Q7 Q8 Q9 Q10 Q11 Q12 Q13 P1 P2 P3 (S11) P4 P5 QBCM Q1 (S11) C C C C C C I C P4 C C C I I C P5 C C I C C C C Mỗi nhà máy (kiểu gen dị hợp tử) là identi fi ed với một lá thư và một số (tên tài liệu tham khảo). Các loài thực vật quý 1 và P3 mang S16 - và S11 - RNase alen tương ứng. Số lượng các tổ hợp gen thực hiện cho mỗi sự kết hợp của các loài cây đã được xác định bởi sự đồng bộ của fl owering và số owers fl có sẵn cho mỗi nhà máy của cha mẹ một mối quan hệ không tương thích: ức chế sự tăng trưởng của ống phấn trong phong cách. Nó có thể được hình dung trong hình. 1b b mối quan hệ tương thích: tăng trưởng bình thường của ống phấn cùng nhụy hoa. Nó có thể được hình dung trong hình. 1a 22 Euphytica (2012) 187: 19-29 123