DNA Extraction from Blood SampleLym

DNA Extraction from Blood Sample
Lymphocytes from whole blood were separated by lysing
the red blood cells (RBCs) using a hypotonic buffer (ammonium
bicarbonate and ammonium chloride; Himedia)
with minimal lysing effect on lymphocytes. Three volumes
of RBC lysis buffer was added to blood sample and mixed
by vortexing and inverting thoroughly for 5 min and centrifuged
(Eppendorf 5415R) at 20,00 g for 10 min. The
supernatant was mostly discarded, leaving behind 1 ml to
prevent loss of cells. To the pellet, 3 vol RBC lysis buffer
was added, and vortexing, inverting, and centrifuging steps
were repeated two to three times until a clear supernatant
and a clean white pellet were obtained. After the final wash,
the supernatant was discarded completely, and the pellet
was resuspended in 500 l PBS, followed by addition of
400 l cell lysis buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA,
50 mM NaCl, 10% SDS, pH 7.5) and 10 l proteinase K
(10 mg/ml stock; Himedia). The sample was vortexed to
dissolve the pellet completely and incubated for 2 h at 56°C
in a water bath (CW-30G; Jeio Tech) for lysis. An equal
volume of phenol (equilibrated with Tris, pH 8) was subsequently
added to the tube and mixed well by inverting for
1 min. The tube was centrifuged at 10,000 g(at 4°C) for 10
min, and the aqueous upper layer was transferred to a fresh
tube containing equal volumes (1:1) of phenol and chloroform:isoamyl
alcohol (24:1). The tube was mixed by inverting
for 1 min and centrifuged for 10 min at 10,000 g(at
4°C). The supernatant was then transferred to a fresh tube,
and 10 l of 10 mg/ml RNase A (Fermentas, Thermo
Scientific) was added.
The sample was incubated at 37°C for 30 min before
an equal volume of chloroform: isoamyl alcohol (24:1) was
added and mixed by inverting the tube for 1 min and
centrifuging at 10,000 g (at 4°C) for 10 min. The supernatant
was transferred to a fresh tube, and twice the volume of
absolute alcohol (Merck) was added and inverted gently a
few times and chilled at 20°C, followed by centrifugation
at 10,000 g at (4°C) for 20 min. The supernatant was
discarded, 250 l 70% ethanol was added, and the pellet

Kết quả (Việt) 1:

Khai thác DNA từ các mẫu máuTế bào lympho từ toàn bộ máu đã được tách ra bởi lysingCác tế bào máu đỏ (RBCs) bằng cách sử dụng một bộ đệm hypotonic (amonibicarbonate và clorua amoni; Himedia)với tối thiểu hiệu ứng lysing trên tế bào lympho. Ba tậpRBC lysis đệm được thêm vào mẫu máu và hỗn hợpbởi vortexing và đảo ngược kỹ lưỡng cho 5 phút và ly(Eppendorf 5415R) tại 20,00 g cho 10 phút cácsupernatant chủ yếu bỏ đi, để lại đằng sau 1 ml đểngăn ngừa rụng của tế bào. Để miếng, 3 vol RBC lysis đệmđã được bổ sung, và vortexing, đảo ngược, và centrifuging bướcđã được lặp đi lặp lại 2-3 lần cho đến khi rõ ràng supernatantvà một miếng trắng sạch đã thu được. Sau khi rửa cuối cùng,supernatant đã bị loại bỏ hoàn toàn, và miếngresuspended trong 500 l PBS, theo sau là bổ sung400 l di động lysis đệm 10 mM (Tris-HCl, 10 mM EDTA,50 mM NaCl, 10% SDS, pH 7,5) và 10 l proteinase K(10 mg/ml cổ phiếu; Himedia). Các mẫu là vortexed đểhòa tan hoàn toàn hạt và ủ cho 2 h 56° Ctrong một nước tắm (CW - 30G; Jeio Tech) cho lysis. Ngangkhối lượng phenol (equilibrated với Tris, pH 8) là sau đóThêm vào các ống và hỗn hợp cũng bởi đảo chiều cho1 phút. Các ống được ly 10.000 g (ở 4° C) 10Min và lớp dung dịch trên được chuyển đến một tươiống có khối lượng bằng nhau (1:1) của phenol và cloroform: isoamylrượu (24:1). Các ống được pha trộn bằng cách đảo ngượccho 1 phút và ly cho 10 phút tại 10.000 g (tại««4 ° C). Supernatant sau đó được chuyển đến một ống tươi,và 10 l 10 mg/ml RNase A (Fermentas, ThermoKhoa học) đã được bổ sung.Các mẫu được ủ ở 37° C trong 30 phút trướcmột khối lượng bằng nhau của cloroform: isoamyl rượu (24:1) làThêm vào và trộn bằng cách đảo ngược ống cho 1 phút vàcentrifuging tại 10.000 g (ở 4° C) cho 10 phút. Supernatantđược chuyển đến một ống tươi, và hai lần khối lượngTuyệt đối rượu (Merck) được thêm vào và đảo ngược nhẹ nhàng mộtvài lần và ướp lạnh ở 20° C, theo sau là sốtại 10.000 g (4° c) cho 20 phút. Supernatantbỏ đi, 250 l 70% ethanol đã được bổ sung, và miếng

Kết quả (Việt) 2:

DNA chiết xuất từ máu mẫu
Lympho từ máu toàn phần được phân cách bằng lysing
các tế bào máu đỏ (hồng cầu) sử dụng một bộ đệm giảm trương lực (ammonium
bicarbonate và amoni clorua; Himedia)
với hiệu ứng lysing tối thiểu trên tế bào lympho. Ba khối lượng
của RBC lysis đệm được thêm vào mẫu máu và trộn
bởi vortexing và nghịch triệt để trong 5 phút và ly tâm
(Eppendorf 5415R) tại 20,00 g trong 10 phút. Các
bề hầu như bỏ đi, để lại đằng sau 1 ml để
tránh mất các tế bào. Để các viên đạn, 3 vol RBC lysis đệm
được thêm vào, và vortexing, đảo ngược, và các bước ly tâm
đã được lặp đi lặp lại 2-3 lần cho đến khi một nổi rõ ràng
và một viên màu trắng sạch đã thu được. Sau khi rửa cuối cùng,
sự nổi đã bị loại bỏ hoàn toàn, và các thức ăn viên
được lơ lửng trong 500 l PBS, tiếp theo là bổ sung của
400 l đệm tế bào ly giải (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA,
50 mM NaCl, 10% SDS, pH 7.5) và 10 l proteinase K
(10 mg / ml chứng khoán; Himedia). Các mẫu được vortexed để
hòa tan hoàn toàn viên và ủ trong 2 giờ ở 56 ° C
trong một cốc nước (CW-30G; Jeio Tech) cho ly giải. Một bằng
khối lượng của phenol (cân bằng với Tris, pH 8) sau đó đã được
thêm vào ống và trộn đều bằng cách đảo ngược cho
1 phút. Ống này được ly tâm ở 10.000 g (ở 4 ° C) trong 10
phút, và các lớp trên dung dịch nước đã được chuyển giao cho một tươi
ống chứa khối lượng bằng nhau (1: 1) phenol và chloroform: isoamyl
alcohol (24: 1). Ống này được trộn lẫn bằng cách đảo ngược
trong 1 phút và ly tâm trong 10 phút ở 10.000 g (ở
4 ° C). Các dịch nổi sau đó đã được chuyển giao cho một ống tươi,
và 10 l 10 mg / ml RNase A (Fermentas, Thermo
Scientific) đã được bổ sung.
Các mẫu được ủ ở 37 ° C trong 30 phút trước khi
một lượng bằng nhau của chloroform: isoamyl alcohol ( 24: 1) đã được
thêm vào và trộn bằng cách đảo ngược ống trong 1 phút và
ly tâm ở 10.000 g (ở 4 ° C) trong 10 phút. Các dịch nổi
được chuyển giao cho một ống tươi, và hai lần khối lượng của
rượu tuyệt đối (Merck) đã được bổ sung và ngược nhẹ nhàng một
vài lần và ướp lạnh tại? 20 ° C, tiếp theo bằng cách ly tâm
ở 10.000 g tại (4 ° C) trong 20 phút . Các dịch nổi được
loại bỏ, 250 l 70% ethanol đã được thêm vào, và thức ăn viên