184 L. Ward et al.
Hình 1. Nhiều liên kết của tất cả các trình tự có sẵn KBV cùng với chuỗi ABPV (cho ABPV, nếu
nhiều hơn một trình tự có sẵn với bản sắc 100% trong khu vực này, chỉ một trong mỗi chuỗi 'loại'
được hiển thị ), cho thấy vị trí của các đoạn mồi và đầu dò thiết kế (trong hộp). Chỉ nucleotide đa hình
được hiển thị, (.) Chỉ ra một nucleotide giống hệt nhau ở vị trí đó.
Số lượng virus KBV tại Anh và Úc
mẫu được ngoại suy từ đường cong chuẩn.
Nồng độ virus đã được bình thường hóa bằng cách chia
các log nghịch đảo của số lượng virus bằng các ngược
log của số lượng IPC ong.
3. KẾT QUẢ
3.1. Thời gian thực mồi và thiết kế đầu dò
Mặc dù KBV và ABPV được chặt chẽ
liên quan đến nó đã có thể phân biệt giữa
hai loại virus bằng cách thiết kế TaqMan?
Mồi và một đầu dò vào khu vực được bảo vệ của
KBV chuỗi nhưng nơi mà các chuỗi ABPV
là biến (Hình. 1, Tab . I). Các KBV khảo nghiệm
đã cho kết quả PCR dương tính khi thử nghiệm với
3 chuẩn bị rút thanh tẩy, KBV14, KBV16
và KBVNZ. Không có phản ứng chéo đã được quan sát
(không khuếch đại sau khi chu kỳ 40 PCR) khi
RNA được chiết xuất từ vi rút tinh khiết hoặc ong
bị nhiễm vi rút sau đây ABPV,
BQCV, Ngân hàng Nhà nước, CWV, SPV, DWV, Đảng và
AIV. Để xác nhận sự hiện diện của virus trong các
kính hiển vi điện tử chuẩn bị rút tinh khiết
đã được thực hiện, và trong mỗi trường hợp hạt virus
của các kích thước chính xác đã được quan sát (dữ liệu
không hiển thị). Đối với các virus tự
đã có sẵn (BQCV, Ngân hàng Nhà nước, DWV và AIV)
sự hiện diện của virus đã được xác nhận bởi RTPCR / PCR
(dữ liệu không hiển thị). Đối với cánh mây
virus (CWV) hiển vi điện tử xác nhận
sự hiện diện của các hạt virus của công đúng
kích thước, trong khi các xét nghiệm KBV đã không phát hiện virus
RNA, mặc dù các trình tự có sẵn
của CWV là giống hệt nhau để KBV. Mặc dù AIV
là một loại virus DNA nó vẫn có thể được phát hiện trong
các chiết RNA từ ong bị nhiễm độc bằng
PCR (không có một bước RT), chỉ ra rằng suf-
DNA ficient được đồng tinh chế trong việc khai thác
thủ tục để cho phép phát hiện hiệu quả.
KBV đã phát hiện thành công trong khác nhau
giai đoạn cuộc sống của Apis mellifera L. bao gồm Úc
ong mật công nhân, nhân viên nhộng và
drone nhộng. Một số công nhân ong mật
từ Mỹ cũng đã thử nghiệm dương tính với vi rút,
cùng với một con ong bắp cày Úc (Vespula Germanica).
Điều này tiếp tục cho thấy rằng các xét nghiệm
phát triển có thể phát hiện các nguồn khác nhau
của KBV trong A. mellifera cũng như KBV ở
khác nhau loài côn trùng. Phát hiện ở loài côn trùng khác
loài được hỗ trợ thêm bởi những thành công
khuếch đại của KBV trình tự từ
các KBV16 chuẩn bị virus, thu được từ một
con ong. Những con ong Đức tất cả các xét nghiệm âm tính
cho KBV, tuy nhiên, kết quả kiểm soát nội bộ
cho thấy mức độ thích đáng của tổng số RNA
đã được trích xuất (Tab. II).
3.2. Khảo sát của các thuộc địa ong mật
cho KBV
RNA chiết xuất từ 5 ong trong từng cuộc điều tra
mẫu đã được thử nghiệm với thời gian thực PCR
phát hiện đầu tiên của virus ong Kashmir ở Anh 185
Bảng II. Kết quả từ thử nghiệm được biết đến mẫu bị nhiễm bệnh và các mẫu nghi ngờ bị KBV nhiễm,
bao gồm cả số mẫu dương tính và các giá trị Ct trung bình và độ lệch chuẩn cho các KBV
khảo nghiệm trong các mẫu dương tính và xét nghiệm kiểm soát nội bộ tích cực trong tất cả các mẫu trích xuất. Các công cụ
ghi lại một giá trị Ct 40 cho các mẫu âm tính (-).
Source loại mẫu số dương Trung bình Ct cho KBV Trung bình Ct cho 18S khảo nghiệm
cá nhân được thử nghiệm mẫu dương tính với tất cả các mẫu
Úc Wasp nhộng 1/2 24,36 23,52 ± 0,18
Úc Mật ong nhân viên nhộng ong 6/6 29,09 ± 3,28 14,64 ± 0,13
Úc Mật ong ong bay không người lái nhộng 3/4 36,18 ± 1,66 14,48 ± 0,23
Úc Mật ong thợ ong 3/10 35,36 ± 6,54 16,48 ± 1,20
Úc Mật ong thợ ong 6/15 36,50 ± 1,63 23,24 ± 3,49
USA Mật ong thợ ong 2/10 31,85 ± 1,45 16,39 ± 1,55
Đức Mật ong thợ ong 0/10 - 17,59 ± 5,12
Đức Mật ong thợ ong 0/10 - 17,38 ± 0,75
xét nghiệm cho rRNA 18S ong (IPC). Sử dụng các
phương pháp chiết xuất tự động, RNA được thành công
phục hồi từ tất cả các mẫu ong. Một
hiệu quả khai thác tương tự cũng được quan sát thấy trong
tất cả các mẫu chỉ ra rằng phương pháp này là tái sản xuất.
Các trung bình real-time PCR Ct (biểu thị
bằng các điểm mà tại đó khuếch đại được
đầu tiên quan sát thấy trên ngưỡng cơ sở) giá trị
cho hai lần nhắc lại từ 458 mẫu khảo sát
là 10,39 ± 1.52.
Sau thử nghiệm bằng cách sử dụng KBV thời gian thực
nghiệm PCR, của 458 mẫu được kiểm tra, ba
dương tính với sự hiện diện của KBV. Hai
của mẫu dương tính được phát hiện tại khác nhau
tổ ong từ các nhà nuôi ong cùng. Chi tiết về
các thuộc địa được thể hiện trong hình 2. Một trong số
các thuộc địa lấy mẫu đã bị nhiễm châu Âu
foulbrood (một bệnh đáng lưu ý theo luật định)
và đã bị phá hủy như là một phần của các quốc gia
chiến lược kiểm soát bệnh. Sản phẩm PCR
AMPLI-fied trong thời gian thực nghiệm PCR đã được
nhân bản vô tính và trình tự. Trình tự của các
chuỗi sản phẩm nhân bản PCR đã được xác nhận
để được KBV sau một vụ nổ tìm kiếm trên
cơ sở dữ liệu NCBI mà phù hợp trình tự khác KBV
(đan có AY275710, AF263723-
AF263732, AY452696).
3.3. Định lượng vi rút tải Anh
mẫu ong
Lượng KBV trong dương Anh
mẫu được so sánh với ong Úc mà
đã được biết đến là nhiễm tự nhiên với KBV
ở mức thấp (không triệu chứng) hoặc mức độ cao
(có triệu chứng lâm sàng). Một tiêu chuẩn
phương pháp đường cong được sử dụng để xác định số lượng tải vi rút
trong cơ thể ong chứ không phải là phương pháp ΔCt như được mô tả
trong Chen et al. (2005). Khi tương đối
hiệu quả của con ong IPC và KBV được
vẽ như ΔCt [Ct (KBV) -Ct (IPC)], so với các bản ghi của
các pha loãng RNA, các ΔCt có một giá trị lớn
hơn 0,1 (độ dốc là 0,9513) , chỉ ra rằng
những hiệu quả khuếch đại của KBV và ong
IPC là không bằng nhau. Trong trường hợp này, các ΔCt
phương pháp không thích hợp để định lượng. Trong
Ngoài ra, là mức khởi điểm của virus và ong
IPC RNA ở các độ pha loãng tiêu chuẩn là không rõ,
tương đối chứ không phải tuyệt đối quantifi-
cation đã được sử dụng.
Một đường cong tiêu chuẩn được xây dựng bằng cách vẽ
các giá trị Ct của ong và KBV RNA chuẩn
pha loãng với nhật ký của pha loãng RNA.
Số lượng KBV và ong IPC RNA
từ mỗi con ong được ngoại suy từ các tiêu chuẩn
đường cong. Số lượng bình thường của KBV
trong mỗi con ong đã được xác định bằng cách chia
số lượng KBV RNA bởi số lượng ong
IPC RNA. Kết quả cho thấy rằng mức độ virus
trong cơ thể ong bị nhiễm bệnh từ nước Anh là tương tự
với những người ở ong với mức độ bí mật của nhiễm
từ Úc. Trong khi đó, những con ong khác
(cũng từ Úc) được cho là nhiễm rất cao,
chứa khoảng virus nhiều hơn 400 lần
so với những con ong ở các site UK Manchester và
rút hơn 100 lần so với nhiễm ngấm ngầm
ong Úc và ong Anh Hull trang web
(Hình. 3).
186 L. Ward et al.
Hình 2. Bản đồ cho thấy vị trí của 458 đàn ong lấy mẫu trong khảo sát KBV UK 2004
bao gồm hai thuộc địa mà dương tính với KBV (chỉ ra bởi những viên kim cương màu đen).
4. THẢO LUẬN
giấy này báo cáo phát hiện đầu tiên của KBV
ở Anh và cuộc điều tra quy mô lớn đầu tiên cho
virus ong ở châu Âu sử dụng công nghệ TaqMan.
Nghiên cứu này chứng tỏ các ứng dụng thực tế
của công nghệ này như một công cụ hỗ trợ
cho các cuộc điều tra và quản lý dự phòng, và
để cung cấp dữ liệu mạnh mẽ giám sát về sự hiện diện
hay không của KBV và mật ong khác
virus.
Sự kết hợp của một xét nghiệm kiểm soát nội bộ
để phát hiện các gen ong 18S rRNA cho phép
đánh giá hiệu quả khai thác và cho phép
giải thích các kết quả âm tính.
phát hiện đầu tiên của virus ong Kashmir ở Anh 187
Hình 3. Định lượng tương đối của KBV trong các mẫu ong. Đường cong (A) TaqMan Chuẩn cho vi rút KBV và
ong IPC. (B) so sánh tương đối của các cấp KBV ở ong Anh liên quan đến loài ong được biết là tự nhiên
bị nhiễm ở mức độ cao và bí mật của nhiễm KBV.
Ngoài ra, các xét nghiệm PCR thời gian thực cho phép
đánh giá định lượng nồng độ virus trong
vài bậc. Điều này được chứng minh
là có giá trị để phát hiện các bệnh nhiễm trùng-titre thấp
trong những con ong được thử nghiệm. Trong nghiên cứu này,
định lượng nồng độ KBV ở ong Anh
cho thấy chúng chứa một hàm tương tự như Úc
ong có nhiễm bí mật. Những con ong
thuộc địa từ các trang web của Anh cho thấy không rõ ràng
dấu hiệu của nhiễm virus tại thời điểm thu
cho thấy virus đã bí mật hoặc tiềm ẩn
trong những apiaries. Nó được biết rằng virus
có thể tồn tại trong con ong hoặc toàn bộ thuộc địa
trong thời gian dài mà không gây chú ý
các triệu chứng lâm sàng (Dall, 1985; Anderson và
Gibbs, 1988;. Hùng et al, 1996a, b). Các nghiên cứu
của Anderson và Gibbs (1988) đã chỉ ra rằng
nhiễm virus bí mật đã được phổ biến trong nhộng
với KBV. Các trạng thái và các trang web nơi mà các
vi rút có thể vẫn còn trong ong trong trạng thái này là
không rõ, tuy nhiên, nó đã được đề nghị
niêm mạc ruột có thể là trang web của 'unapparent'
nhiễm hay bí mật (Anderson và Gibbs,
1989). Anderson và Gibbs (1988) đã tuyên bố
rằng những nhiễm khuẩn không có một khả năng tiềm ẩn
để trở thành thành viên mới và phát triển thành cấp tính
nhiễm trùng.
Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng virus
như KBV và ABPV có thể tồn tại như là tự nhiên
bệnh nhiễm trùng trong một phạm vi rộng lớn hơn của chi khác
hơn Apis . Ví dụ KBV đã được phát hiện
trong ong Vespula Germanica (Anderson,
1991) và ABPV trong loài Bombus (Bailey
và Gibbs, 1964). Nghiên cứu của chúng tôi cung cấp thêm
hỗ trợ cho việc này, như KBV đã được phát hiện trong
cùng một loài ong bắp cày và một trong những KBV
týp huyết thanh thử nghiệm được chiết xuất từ một ong
từ New Zealand. Về thương mại và
quy định của virus ong mật giữa các quốc gia,
nếu những loại virus tồn tại trong côn trùng khác nhau
host, nó làm cho điều khiển như thế và hạn chế
khó khăn để áp đặt hoặc biện minh. Trong quan điểm này,
các máy chủ lưu trữ đầy đủ các virus ong Warrants
nghiên cứu thêm.
Tại thời điểm lấy mẫu, cả ba KBV tích cực
các thuộc địa Anh ở trong tình trạng tốt, với
số lành mạnh của con ong trưởng thành và bố mẹ, tuy nhiên,
các thuộc địa đã bị nhiễm varroa
và một trong các thuộc địa đã được tìm thấy có châu Âu
foulbrood (EFB). Các hiệp hội of184 L. Ward et al.
Hình 1. Nhiều liên kết của tất cả các trình tự có sẵn KBV cùng với chuỗi ABPV (cho ABPV, nếu
đang được dịch, vui lòng đợi..