DNA Extraction from Hair SampleDNA

DNA Extraction from Hair Sample
DNA was isolated from hair shafts using modified versions
of the microscopic glass-grinding and organic solvent extraction
protocol.12–14 As these protocols expose the specimen
to increased risks of contamination, the present study
has replaced the tedious physical digestion method with a smooth chemical digestion method using dithiothreitol
(DTT) (Hi-media) as it is a strong reducing agent with
relatively high salt content and also an anionic detergent.
Digestion buffer (500 l; 10 mM Tris-HCl, 10 mM
EDTA, 50 mM NaCl, 20% SDS, pH 7.5) was added to a
1.5-ml microcentrifuge tube, along with 40 l of 1 M
DTT (to a final concentration of 80 mM, 240 mM of
sodium acetate, pH 5.2) and 15 l of 10 mg/ml proteinase
K (to a final concentration of 0.3 mg/ml; Himedia). Hair
sample was added to this solution before vortexing and
incubating for 2 h at 56°C. After 2 h of incubation, the
sample tube was vortexed again, and an additional 40 l of
1 M DTT and 15 l of 10 mg/ml proteinase K were added,
followed by gentle mixing and incubation at 60°C for 2
more h or until hair was dissolved completely.
The DNA was then extracted from each sample with
an equal volume of phenol:chloroform: isoamyl alcohol
solution (25:24:1) and mixed gently by inverting the tube
for a few minutes. The samples were centrifuged (Eppendorf
5415R) for 10 min with 10,000 g (4°C), followed by
transferring the upper aqueous layer into a fresh, sterilized
microcentrifuge tube. RNaseA (10 l of 10 mg/ml; Fermentas,
Thermo Scientific) was added and kept for incubation
at 37°C for 30 min. An equal volume of chloroform:
isoamyl alcohol was added, and the tube was centrifuged
(Eppendorf 5415R) again at10,000 g (4°C) for 10 min.
The upper aqueous layer was transferred into a fresh, sterilized
microcentrifuge tube before double the volume of
chilled isopropanol and one-tenth volume of 3 M sodium
acetate were added. The sample was chilled at 20°C for 1
h for the DNA precipitation to occur. The sample was
centrifuged (Eppendorf 5415R) at 10,000 g (4°C) for 10
min. The supernatant was discarded, 250 l 70% ethanol
was added, and the pellet was tapped gently before further
centrifugation (Eppendorf 5415R) at 10,000 rpm for 10
min. The supernatant was discarded, and the pellet was
air-dried in a laminar air flow, resuspended in 50 l nuclease-free
water or 1 TE buffer, and frozen at 20°C or
80°C for storage.

Kết quả (Việt) 1:

Khai thác DNA từ các mẫu tócDNA được phân lập từ các trục tóc bằng cách sử dụng phiên bản sửa đổicủa các vi thủy tinh mài và hữu cơ chiết dung môiProtocol.12–14 như các giao thức này tiếp xúc với các mẫu vậtđể gia tăng nguy cơ ô nhiễm, các nghiên cứu hiện nayđã thay thế các phương pháp tiêu hóa vật lý tẻ nhạt với một phương pháp tiêu hóa hóa chất mịn bằng cách sử dụng dithiothreitol(DTT) (Hi-phương tiện truyền thông) vì nó là một chất khử mạnh mẽ vớinội dung muối tương đối cao và cũng là một chất tẩy rửa anion.Bộ đệm tiêu hóa (500 l; 10 mM Tris-HCl, 10 mMEDTA, 50 mM NaCl, 20% SDS, pH 7,5) đã được thêm vào mộtống 1.5 ml microcentrifuge, cùng với 40 l 1 mDTT (với nồng độ cuối cùng của 80 mM, 240 mMnatri axetat, pH 5.2) và 15 l proteinase 10 mg/mlK (nồng độ cuối cùng của cách 0.3 mg/ml; Himedia). Tócmẫu được đưa vào các giải pháp này trước khi vortexing vàấp cho 2 h 56° C. Sau 2 h ấp, cácmẫu ống là vortexed một lần nữa, và một bổ sung 40 l của1 M DTT và 15 l 10 mg/ml proteinase K đã được thêm vào,tiếp theo là nhẹ nhàng trộn và ủ ở 60° C cho 2hơn h hoặc cho đến khi tóc đã được hòa tan hoàn toàn.DNA sau đó được chiết xuất từ mỗi mẫu vớimột khối lượng bằng nhau của phenol: cloroform: isoamyl rượugiải pháp (25:24:1) và trộn nhẹ nhàng bằng cách đảo ngược ốngcho một vài phút. Các mẫu được ly (Eppendorf5415R) trong 10 phút với 10.000 g (4 ° C), tiếp theochuyển lớp dung dịch trên vào tươi một, tiệt trùngống microcentrifuge. RNaseA 10 l (10 mg/ml; Fermentas,Khoa học nhiệt) được thêm vào và giữ cho ấp trứngở 37° C trong 30 phút. Một khối lượng bằng nhau của cloroform:isoamyl rượu đã được bổ sung, và các ống được ly(Eppendorf 5415R) một lần nữa at10, 000 g (4° C) cho 10 phút.Lớp dung dịch trên được chuyển thành một tươi, tiệt trùngmicrocentrifuge ống trước khi tăng gấp đôi khối lượngướp lạnh isopropanol và một phần mười khối lượng 3 M natriaxetat được thêm vào. Các mẫu được ướp lạnh ở 20° C cho 1h cho mưa DNA để xảy ra. Các mẫuly (Eppendorf 5415R) tại 10.000 g (4° C) 10min. Supernatant đã được loại bỏ, 250 l 70% ethanolđã được bổ sung, và miếng đã được khai thác nhẹ nhàng trước khi tiếp tụcsố (Eppendorf 5415R) tại 10.000 vòng/phút cho 10min. Supernatant đã bị loại bỏ, và miếng đãAir-DRIED trong một dòng chảy tầng ép máy, resuspended trong 50 l nuclease miễn phínước hoặc 1-TE-đệm, và đông lạnh ở 20° C hay80° C cho việc lưu trữ.

Kết quả (Việt) 2:

DNA chiết xuất từ mẫu tóc
DNA được phân lập từ trục tóc sử dụng phiên bản sửa đổi
của kính mài và chiết dung môi hữu cơ vi
protocol.12-14 Khi các giao thức lộ mẫu
để gia tăng nguy cơ ô nhiễm, nghiên cứu này
đã thay thế tiêu hóa vật lý tẻ nhạt phương pháp với một mịn phương pháp tiêu hóa hóa học sử dụng dithiothreitol
(DTT) (Hi-media) vì nó là một chất khử mạnh với
hàm lượng muối tương đối cao và cũng là một chất tẩy rửa anion.
Tiêu hóa bộ đệm (500 l; 10 mM Tris-HCl, 10 mM
EDTA , 50 mM NaCl, 20% SDS, pH 7.5) đã được thêm vào một
ống microcentrifuge 1,5 ml, cùng với 40 l của 1 M
DTT (với nồng độ cuối cùng của 80 mM, 240 mM
sodium acetate, pH 5.2) và 15 l 10 mg / ml proteinase
K (với nồng độ cuối cùng là 0,3 mg / ml; Himedia). Tóc
mẫu đã được thêm vào dung dịch này trước khi vortexing và
ủ trong 2 giờ ở 56 ° C. Sau 2 giờ ủ, các
ống mẫu được vortexed một lần nữa, và thêm 40 lít
1 M DTT và 15 l 10 mg / ml proteinase K đã được thêm vào,
theo sau là trộn nhẹ nhàng và ủ ở 60 ° C trong 2
h hơn hoặc . cho đến khi tóc đã được hòa tan hoàn toàn
DNA sau đó đã được rút ra từ mỗi mẫu với
một lượng bằng nhau của phenol: chloroform: isoamyl rượu
giải pháp (25: 24: 1) và trộn nhẹ nhàng bằng cách đảo ngược ống
cho một vài phút. Các mẫu được ly tâm (Eppendorf
5415R) trong 10 phút với 10.000 g (4 ° C), tiếp theo là
chuyển lớp nước trên thành một, tiệt trùng tươi
ống microcentrifuge. RNaseA (10 l 10 mg / ml; Fermentas,
Thermo Scientific) đã được bổ sung và giữ để ủ
ở 37 ° C trong 30 phút. Một lượng bằng nhau của chloroform:
rượu isoamyl đã được thêm vào, và ống được ly tâm
(Eppendorf 5415R) một lần nữa at10,000 g (4 ° C) trong 10 phút.
Các lớp nước phía trên đã được chuyển thành một, tiệt trùng tươi
ống microcentrifuge trước khi tăng gấp đôi khối lượng của
isopropanol lạnh và khối lượng một phần mười của 3 M sodium
acetate được thêm vào. Các mẫu được ướp lạnh tại? 20 ° C trong 1
giờ cho kết tủa DNA xảy ra. Các mẫu được
ly tâm (Eppendorf 5415R) ở 10.000 g (4 ° C) trong 10
phút. Các bề đã được bỏ đi, 250 l 70% ethanol
đã được thêm vào, và viên đã được khai thác một cách nhẹ nhàng trước khi tiếp tục
ly tâm (Eppendorf 5415R) tại 10.000 rpm trong 10
phút. Các bề đã được bỏ đi, và thức ăn viên được
không khí khô trong một dòng chảy không khí laminar, lơ lửng trong 50 l nuclease miễn
nước hay 1? TE đệm, và đông lạnh tại? 20 ° C hoặc
? 80 ° C để lưu trữ.