primers that target either the rRNA

primers that target either the rRNA genes at different taxonomic levels from phylum to species, or the functional genes of interest. At this stage, if concentrations of target groups need to be quantified, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) is usually employed. After generating PCR amplicons, various molecular techniques have been applied in profiling the microbial community prior to sequencing, such as the cloning approach and DGGE fingerprint technique.
Cloning and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
The construction of clone libraries and sequencing of PCR-amplified fragments is a commonly used means of assessing microbial community composition and diversity. Despite the fact that the cloning approach is more expensive and time-consuming than the commonly used fingerprinting techniques such as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), sequence analysis of clone libraries provides an unparalleled level of phylogenetic resolution due to the relatively long read lengths generated by Sanger sequencing (Leigh et al., 2010). However, the scale of the microbial community is usually far too large to be fully explored, and it is therefore difficult to estimate the number of required sequenced clones to be able to reach the desired coverage in the target samples (Hui, 2010).
DGGE is a molecular fingerprint
technique for analysing microbial
community composition and diversity, which separates double-stranded PCR products of a similar length but different sequence composition. Prior to DGGE, a 5’-GC-rich sequence (30-50 nucleotides, called ‘GC clamp’) is incorporated at the end of the forward primer (Muyzer et al., 1993). Different sequences of DNA are denatured at different denaturant
concentrations, resulting in a pattern of bands, with each band representing a different bacterial population present in the community. DGGE patterns can be used in two alternative manners to study the microbial community composition.
Firstly, DGGE provides an immediate display of the constituents in both a qualitative and a semi-quantitative way by demonstrating the locations of DNA patterns of the target samples. Alternatively, a subsequent DGGE-PCR can be conducted. However, the DGGE approach also has major limitations. Firstly, it only identifies the key microbial species with a high abundance, and numerically rare phylotypes are not generally detected. Muyzer et al. (1993) suggested that any target DNA that is less than 1% of the total target pool is unlikely to be detected by DGGE. As such, DGGE analyses should be considered to indicate only the predominant organisms or ‘phylotypes’ in a community. Moreover, several microbial species may share the same DGGE pattern (Costa et al., 2006). To better separate different sequences, DNA cloning technology can be utilized.
Once sequences are obtained using cloning and DGGE approaches and verified for base-call accuracy, sequences may be compared to databases such as Genbank, the Ribosomal Database Project (RDP) and EMBL (http://www.ebi.ac.uk/ena/) to determine the taxonomic affiliations of the source organisms. Bacterial sequences have been assigned to the level the phylum, class, order, family, genus or species at sequence similarity cut-off values of 80, 85, 90, 92, 94 or 97%, respectively (DeSantis et al., 2007), because most organisms with

Kết quả (Việt) 1:

lớp lót nhắm mục tiêu các gen rRNA tại cấp độ phân loại khác nhau từ ngành loài hoặc các gen chức năng quan tâm. Ở giai đoạn này, nếu nồng độ của mục tiêu nhóm cần được định lượng, một phản ứng chuỗi trùng hợp định lượng (qPCR) thường được sử dụng. Sau khi tạo ra các đảng Cộng sản Romania amplicons, kỹ thuật phân tử khác nhau đã được áp dụng trong hồ sơ cộng đồng vi sinh vật trước khi trình tự, chẳng hạn như nhân bản phương pháp tiếp cận và DGGE vân tay kỹ thuậtNhân bản và biến tính độ dốc gel điện (DGGE)Xây dựng thư viện nhân bản và trình tự của Đảng Cộng sản Romania khuếch đại đoạn là một phương tiện phổ biến sử dụng đánh giá thành phần vi khuẩn cộng đồng và sự đa dạng. Mặc dù thực tế rằng phương pháp nhân bản là hơn đắt tiền và tốn thời gian hơn so với các kỹ thuật fingerprinting thường được sử dụng như biến tính độ dốc gel điện (DGGE), phân tích chuỗi các bản sao thư viện cung cấp một mức độ tuyệt vời của các nghị quyết phát sinh loài do chiều dài tương đối dài đọc được tạo ra bởi Sanger xác định trình tự (Leigh và ctv., 2010). Tuy nhiên, quy mô của cộng đồng vi khuẩn thường là quá lớn để được khám phá hoàn toàn, và do đó rất khó để ước tính số lượng yêu cầu dòng vô tính nói để có thể đạt được bảo hiểm mong muốn trong mục tiêu mẫu (Hui, 2010).DGGE là một phân tử dấu vân taykỹ thuật cho việc phân tích vi sinh vậtcộng đồng thành phần và sự đa dạng, chia tách đôi-stranded PCR sản phẩm một chiều dài tương tự nhưng khác nhau trình tự thành phần. Trước khi DGGE, một chuỗi 5' GC-giàu (30-50 nucleotide, được gọi là 'GC kẹp') được hợp nhất vào cuối phía trước mồi (Muyzer và ctv., 1993). Các trình tự khác nhau của các DNA được denatured lúc khác nhau denaturantnồng độ, dẫn đến một mô hình của ban nhạc, với mỗi ban nhạc đại diện cho một dân số vi khuẩn khác nhau hiện diện trong cộng đồng. DGGE mẫu có thể được sử dụng trong hai cách cư xử thay thế để nghiên cứu thành phần cộng đồng vi sinh vật.Trước hết, DGGE cung cấp một hiển thị ngay lập tức của các thành phần trong cả hai một chất lượng và cách bán định lượng bằng chứng tỏ vị trí của mô hình DNA của các mẫu mục tiêu. Ngoài ra, DGGE sau đó một-đảng Cộng sản Romania có thể được thực hiện. Tuy nhiên, phương pháp tiếp cận DGGE cũng có những hạn chế lớn. Trước hết, nó chỉ xác định các loài vi khuẩn chính với một sự phong phú cao, và số lượng hiếm phylotypes nói chung không được phát hiện. Muyzer et al. (1993) gợi ý rằng bất kỳ mục tiêu ADN đó là ít hơn 1% của các hồ bơi tất cả mục tiêu là dường như không được phát hiện bởi DGGE. Như vậy, DGGE phân tích cần được xem xét để cho biết chỉ là các sinh vật chủ yếu hay 'phylotypes' trong một cộng đồng. Hơn nữa, một vài loài vi khuẩn có thể chia sẻ cùng một khuôn mẫu DGGE (Costa và ctv., 2006). Để tốt hơn riêng biệt khác nhau trình tự, DNA công nghệ nhân bản có thể được sử dụng.Một khi trình tự được thu được bằng cách sử dụng nhân bản và DGGE phương pháp tiếp cận và xác minh cho căn cứ gọi chính xác, Chuỗi có thể được so sánh với cơ sở dữ liệu chẳng hạn như Genbank, dự án cơ sở dữ liệu ribosome (RDP) và EMBL (http://www.ebi.ac.uk/ena/) để xác định hệ với phân loại của các sinh vật nguồn. Vi khuẩn chuỗi đã được giao cho cấp ngành, lớp học, đặt hàng, gia đình, chi hoặc loài tại chuỗi tương tự cắt giá trị của 80, 85, 90, 92, 94 hay 97%, tương ứng (DeSantis et al., 2007), bởi vì hầu hết sinh vật với < 97% trình tự tương tự

Kết quả (Việt) 2:

mồi mà mục tiêu hoặc là các gen rRNA ở các mức phân loại khác nhau từ phylum loài, hoặc các gen chức năng quan tâm. Ở giai đoạn này, nếu nồng độ của các nhóm mục tiêu cần phải được định lượng, một phản ứng dây chuyền polymerase định lượng (qPCR) thường được sử dụng. Sau khi tạo ra amplicon PCR, kỹ thuật phân tử khác nhau đã được áp dụng trong profiling cộng đồng vi khuẩn trước khi trình tự, chẳng hạn như các phương pháp nhân bản và DGGE kỹ thuật dấu vân tay.
Cloning và biến tính điện Gradient gel (DGGE)
Việc xây dựng các thư viện bản và trình tự của PCR-khuếch đại mảnh vỡ là một phương tiện thường được sử dụng để đánh giá thành phần cộng đồng vi khuẩn và sự đa dạng. Mặc dù thực tế rằng các phương pháp nhân bản vô tính là tốn kém hơn và tốn nhiều thời gian hơn so với các kỹ thuật lấy dấu vân tay thường được sử dụng như làm biến tính Gradient gel electrophoresis (DGGE), phân tích trình tự của thư viện bản sao cung cấp một mức độ chưa từng có độ phân giải phát sinh loài do độ dài tương đối dài đọc tạo bởi Sanger sequencing (Leigh et al., 2010). Tuy nhiên, quy mô của các cộng đồng vi khuẩn thường là quá lớn để được khám phá đầy đủ, và vì thế rất khó để ước tính số lượng yêu cầu bắt chước trình tự để có thể đạt được bao phủ mong muốn trong các mẫu mục tiêu (Hui, 2010).
DGGE là một dấu vân tay phân tử
kỹ thuật để phân tích vi sinh vật
thành phần của cộng đồng và đa dạng, trong đó tách các sản phẩm sợi đôi PCR có chiều dài tương tự nhưng phần trình tự khác nhau. Trước DGGE, một trình tự 5'-GC-giàu (30-50 nucleotide, được gọi là 'GC kẹp') được thành lập vào cuối những mồi xuôi (Muyzer et al., 1993). Trình tự khác nhau của DNA được biến tính ở biến tính khác nhau
nồng, kết quả là một mô hình của ban nhạc, với mỗi băng đại diện cho một món quà dân số vi khuẩn khác nhau trong cộng đồng. Mẫu DGGE có thể được sử dụng trong hai cách thay thế để nghiên cứu các thành phần cấu tạo của vi sinh vật.
Thứ nhất, DGGE cung cấp một màn hình trước mắt của các thành phần trong cả một định tính và bán một cách định lượng bằng cách chứng minh vị trí của các mẫu DNA của các mẫu mục tiêu. Ngoài ra, một tiếp theo DGGE-PCR có thể được tiến hành. Tuy nhiên, cách tiếp cận DGGE cũng có những hạn chế lớn. Thứ nhất, nó chỉ nhận dạng các loài vi sinh vật quan trọng với một phong phú cao, và số lượng phylotypes hiếm thường không phát hiện. Muyzer et al. (1993) cho rằng bất kỳ DNA mục tiêu đó là ít hơn 1% của tổng số hồ mục tiêu khó có thể phát hiện bằng DGGE. Như vậy, phân tích DGGE cần được xem xét để cho biết chỉ những sinh vật chiếm ưu thế hoặc 'phylotypes' trong một cộng đồng. Hơn nữa, một số loài vi sinh vật có thể chia sẻ các mô hình DGGE cùng (Costa et al., 2006). Để trình tự khác nhau riêng biệt tốt hơn, công nghệ nhân bản DNA có thể được sử dụng.
Sau khi trình tự thu được bằng cách sử dụng các phương pháp nhân bản và DGGE và xác minh cho tính chính xác cơ sở gọi, trình tự có thể được so sánh với cơ sở dữ liệu như GenBank, Dự án Cơ sở dữ liệu ribosome (RDP) và EMBL ( http://www.ebi.ac.uk/ena/) để xác định các đảng phái phân loại của sinh vật nguồn. Trình tự của vi khuẩn đã được phân công đến mức các phylum, lớp, trật tự, gia đình, chi hoặc loài cây tại chuỗi tương tự giá trị cut-off của 80, 85, 90, 92, 94 hoặc 97%, tương ứng (DeSantis et al., 2007) , bởi vì hầu hết các sinh vật với <97% tương tự