Effect of ponicidin or oridonin on

Effect of ponicidin or oridonin on induction of apoptosis and cell cycle progression. Cell cycle phase distribution was analyzed by flow cytomFig. 1. Structural formulas of ponicidin and oridonin. etry. Cultures were incubated with 5 lM ponicidin or oridonin for 3 days and arvested. Cells were washed once with PBS and stained with 1.0 lg/ml 4,6-diamidion-2-phenylindole (DAPI; Molecular Probes, Eugene, OR) in a solution containing 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, and 0.1% Triton X-100, pH 6.8, as described [21,22]. The DNA-specific DAPI fluorescence was excited with UV light and collected with appropriate filters in an ICP-22 flow cytometer (Ortho Diagnostic,
Westwood, MA). The cell cycle distribution and percentage of apoptotic cells were analyzed by deconvoluting the DNA content frequency histograms with the use of CellFit software (Phoenix Flow, San Diego, CA), as detailed previously [22]. Protein extraction and Western blot analysis. Control and treated cells were rinsed with ice-cold PBS, suspended in buffer (50 ll/106 cells) containing 10 mM Hepes, pH 7.5, 90 mM KCl, 1.5 mM Mg(OAc)2, 1 mM dithiothreitol, 0.5% NP40, and 5% glycerol supplemented with 0.5 mM PMSF, 10 lg/ml each of aprotinin, pepstatin, and leupeptin, and lysed by three freeze/thaw cycles [18,19]. The extracts were centrifuged and the clear supernatants were stored in aliquots at
70 C. Protein concentrations were measured with protein assay reagent (Pierce Chem., Rockford, IL). For Western blot analysis, 10 lg proteins were boiled for 5 min in Laemmli buffer and separated by 10% SDS–polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS–PAGE). The gels were transferred to nitrocellulose membranes by a semi-dry transfer method. After blocking with buffer containing 5% low-fat milk, the membranes were probed for the expression of cyclins B, D1,and E, cdc2, CDK 4, E2F, Rb, NF-jB p65 and p50, IjB, and b-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Site-specific Rb antibodies (Ser 780 and Thr 821) were purchased from Biosource International (Camarillo, CA). All antibodies used in the experiments were diluted at 1:1000. Specific immunoreactivity was demonstrated by
enhanced chemiluminescence (ECL) or color reaction using procedures detailed in the manufacturer
s protocol (Kirkegared & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD).

Kết quả (Việt) 1:

Tác dụng của ponicidin hoặc oridonin về cảm ứng của thăng tiến quá trình chết rụng và chu kỳ tế bào. Chu kỳ tế bào giai đoạn phân phối được phân tích bởi cytomFig dòng chảy. 1. công thức cấu trúc của ponicidin và oridonin. etry. Nền văn hóa đã được ủ với 5 lM ponicidin hoặc oridonin cho 3 ngày và arvested. Tế bào đã được rửa sạch một lần với PBS và màu với 1.0 lg/ml 4,6-diamidion-2-phenylindole (DAPI; Phân tử đầu dò, Eugene, OR) trong một dung dịch chứa 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2 và 0.1% Triton X-100, pH 6.8, như được mô tả [21,22]. Huỳnh quang dành riêng cho DNA DAPI đã vui mừng với tia UV và thu thập với các bộ lọc phù hợp trong một dòng chảy ICP-22 cytometer (Ortho chẩn đoán,Westwood, MA). The cell cycle distribution and percentage of apoptotic cells were analyzed by deconvoluting the DNA content frequency histograms with the use of CellFit software (Phoenix Flow, San Diego, CA), as detailed previously [22]. Protein extraction and Western blot analysis. Control and treated cells were rinsed with ice-cold PBS, suspended in buffer (50 ll/106 cells) containing 10 mM Hepes, pH 7.5, 90 mM KCl, 1.5 mM Mg(OAc)2, 1 mM dithiothreitol, 0.5% NP40, and 5% glycerol supplemented with 0.5 mM PMSF, 10 lg/ml each of aprotinin, pepstatin, and leupeptin, and lysed by three freeze/thaw cycles [18,19]. The extracts were centrifuged and the clear supernatants were stored in aliquots at
70 C. Protein concentrations were measured with protein assay reagent (Pierce Chem., Rockford, IL). For Western blot analysis, 10 lg proteins were boiled for 5 min in Laemmli buffer and separated by 10% SDS–polyacrylamide gel electrophoresis(SDS–PAGE). The gels were transferred to nitrocellulose membranes by a semi-dry transfer method. After blocking with buffer containing 5% low-fat milk, the membranes were probed for the expression of cyclins B, D1,and E, cdc2, CDK 4, E2F, Rb, NF-jB p65 and p50, IjB, and b-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Site-specific Rb antibodies (Ser 780 and Thr 821) were purchased from Biosource International (Camarillo, CA). All antibodies used in the experiments were diluted at 1:1000. Specific immunoreactivity was demonstrated byenhanced chemiluminescence (ECL) or color reaction using procedures detailed in the manufacturer
s protocol (Kirkegared & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD).

Kết quả (Việt) 2:

Ảnh hưởng của ponicidin hoặc oridonin trên cảm ứng apoptosis và chu kỳ tế bào tiến triển. Phân phối giai đoạn chu kỳ tế bào được phân tích bởi dòng chảy cytomFig. 1. công thức cấu của ponicidin và oridonin. etry. Nuôi cấy được ủ với 5 LM ponicidin hoặc oridonin trong 3 ngày và arvested. Các tế bào được rửa sạch một lần với PBS và nhuộm với 1.0 lg / ml 4,6-diamidion-2-phenylindole (DAPI; Molecular Probes, Eugene, OR) trong một dung dịch chứa 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, và 0,1% Triton X 100, pH 6.8, như được mô tả [21,22]. Các DNA cụ thể DAPI huỳnh quang đã vui mừng với ánh sáng UV và được thu cùng với bộ lọc thích hợp trong một ICP-22 luồng cytometer (Ortho chẩn đoán,
Westwood, MA). Sự phân bố chu kỳ tế bào và tỷ lệ phần trăm của các tế bào tự hủy đã được phân tích bởi deconvoluting DNA biểu đồ tần số nội dung với việc sử dụng các phần mềm CellFit (Phoenix Flow, San Diego, CA), như chi tiết trước đây [22]. Chiết protein và phân tích Western blot. Kiểm soát và các tế bào được xử lý được rửa sạch bằng nước đá lạnh PBS, lơ lửng trong bộ đệm (50 ll / 106 tế bào) có chứa 10 mM Hepes, pH 7,5, 90 mM KCl, 1,5 mM Mg (OAC) 2, 1 mM dithiothreitol, 0,5% NP40, và 5% glycerol có bổ sung 0,5 mM PMSF, 10 lg / ml mỗi aprotinin, pepstatin, và leupeptin, và ly giải bởi ba chu kỳ đóng băng / tan băng [18,19]. Các chất chiết xuất được ly tâm và các nước nổi rõ ràng đã được lưu trữ trong phần phân ước tại? 70 C. nồng độ protein được đo bằng xét nghiệm protein thuốc thử (Pierce Chem., Rockford, IL). Đối với phân tích Western blot, 10 protein lg được đun sôi trong 5 phút trong Laemmli đệm và cách nhau bằng 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS-PAGE). Các gel đã được chuyển giao cho màng nitrocellulose bằng một phương pháp chuyển giao bán khô. Sau khi chặn với đệm có chứa 5% sữa ít chất béo, các màng được khảo sát cho sự biểu hiện của cyclin B, D1, và E, cdc2, CDK 4, E2F, Rb, NF-JB p65 và P50, IjB, và b-actin (Santa Cruz Công nghệ sinh học, Santa Cruz, CA). Kháng thể Rb trang web cụ thể (Ser 780 và Thr 821) được mua từ Biosource International (Camarillo, CA). Tất cả các kháng thể được sử dụng trong các thí nghiệm đã được pha loãng 1: 1000. Immunoreactivity cụ thể đã được chứng minh bởi
tăng cường Chemiluminescence (ECL) hoặc phản ứng màu sắc bằng cách sử dụng các thủ tục chi tiết trong các nhà sản xuất giao thức? S (Kirkegared & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD).