Expression and purification of reco

Expression and purification of recombinant proteins 100 μL frozen glycerol stock with the recombinant strain was inoculated into 50 mL of LB media containing
35 μg mL-1 kanamycin and 50 μg mL-1 chloramphenicol in a 250 mL flask on an incubator shaker (200 rpm) at 37oC. The 100 mM IPTG (Sigma, USA) stock was filtersterilized using a 0.22 lm filter and stored at -20 C. IPTG was then added to the cultures at a final concentration of 1 mM when the optical density of the cultures reached 0.3 at 600 nm (OD600) [7]. The cells were harvested after 6 h of cultivation by centrifugation at 6,000g at 4 C for 10 min to pellet the cells. The media was removed, and the cells were resuspended in PBS buffer (10 mM Na2HPO4,
1.8 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 8.0) at a ratio of 5 mL buffer for each gram of cell wet weight. Lysozyme (Sigma, USA) was added to a final concentration of 5 mg mL-1, and the cell suspension was incubated on ice for 2 h. Triton X-100 was added to a concentration of 1 % (v/v), and the tube vigorously agitated. DNase and RNase (TransGen, China) were added to a final concentration
of 5 μg mL-1, and the cells were incubated with rocking for an additional 10 min at 4 C. The insoluble debris was removed by centrifugation at 5,000g, 4 C for 10 min. The supernatant was collected and placed in an 80 C water bath for 25 min, cooled on ice for 20 min, and then centrifuged at 10,000g, 4 C for 20 min. The supernatant
was loaded onto a Ni2+-NTA agarose column (NERCB, China) that was
pre-equilibrated with 5x column volumes phosphate buffer (20 mM, pH 8.0) plus 50 mM NaCl. The column was eluted with a 20–500 mM imidazole gradient in 20 mM phosphate buffer (pH 8.0) plus 50 mM NaCl. The flow-through fraction was pooled and dialyzed against 20 mM phosphate buffer (pH 8.0) at room temperature overnight and finally concentrated using a Centrifugal Filter Unit (Millipore, USA). The SDS-PAGE gel electrophoresis was performed using a 5 % stacking gel and a 15 % separating gel (Bio-Rad Laboratories, USA).
Induction strategy
The defined medium (DM) for the shake flask cultures was composed of (g L-1) 10 glycerol, 15 K2HPO4, 7.5 KH2-PO4, 2.5(NH4)2SO4, 2 MgSO47H2O, 2 citric acid, and 1 mL of a trace elements solution. The trace elements solution contained (g L-1): 1.5 CaCl22H2O, 3.0 ZnSO4-7H2O, 2.8 CoSO47H2O, 0.2 CuCl22H2O, 2.0 MnCl2-4H2O, and 2.8 FeSO47H2O. The DM was supplemented with 35 μg mL-1 kanamycin and 50 μg mL-1 chloramphenicol.

Kết quả (Việt) 1:

Biểu hiện và thanh lọc của tái tổ hợp protein 100 μL đông lạnh glyxêrin cổ với tái tổ hợp chủng được tiêm chủng vào 50 mL của LB phương tiện truyền thông có chứa35 μg mL-1 kanamycin và 50 μg mL-1 chloramphenicol trong một flask 250 mL trên một shaker vườn ươm (200 rpm) tại 37oC. IPTG (Sigma, Hoa Kỳ) 100 mM báng là filtersterilized bằng cách sử dụng một bộ lọc lm 0,22 và được lưu trữ tại - 20 C. IPTG sau đó đã được thêm vào các nền văn hóa tại nồng độ cuối cùng của 1 mM khi mật độ quang học của các nền văn hóa đến 0,3 tại 600 nm (OD600) [7]. Các tế bào đã được thu hoạch sau 6 h trồng bởi số 6.000 g tại 4 C cho 10 phút để pellet các tế bào. Phương tiện truyền thông đã được gỡ bỏ, và các tế bào đã được resuspended trong bộ đệm PBS (10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 8,0) tại một tỷ lệ 5 mL đệm cho mỗi gam trọng lượng tế bào ướt. Lysozyme (Sigma, Hoa Kỳ) đã được bổ sung với một nồng độ cuối cùng của 5 mg mL-1, và đình chỉ tế bào được ủ trên băng cho 2 h. Triton X-100 đã được thêm vào nồng độ của 1% (v/v), và các ống giao động mạnh mẽ. DNase và RNase (TransGen, Trung Quốc) đã được thêm vào với một nồng độ cuối cùngcủa 5 μg mL-1, và các tế bào đã được ủ với rocking cho một bổ sung 10 phút ở 4 C. Các mảnh vỡ không hòa tan được rút số 5, 000g, 4 C trong 10 phút. Supernatant được thu thập và đặt trong một bồn tắm nước 80 C cho 25 phút, làm mát bằng nước trên băng cho 20 phút, và sau đó ly lúc 10, 000g, 4 C cho 20 phút. Supernatantđược nạp vào một Ni2 +-NTA agarose cột (NERCB, Trung Quốc) đã trước equilibrated với 5 x cột tập phosphat đệm (20 mM, độ pH 8,0) cộng với 50 mM NaCl. Các cột eluted với một gradient imidazole 20-500 mM trong 20 mM phosphat đệm (pH 8,0) cộng với 50 mM NaCl. Các dòng chảy qua phần được gộp lại và dialyzed chống lại 20 mM phosphat đệm (pH 8,0) ở nhiệt độ phòng qua đêm và cuối cùng tập trung bằng cách sử dụng một đơn vị lọc ly tâm (Millipore, Hoa Kỳ). Dùng mũi SDS-trang gel điện được thực hiện bằng cách sử dụng một gel xếp 5% và 15% tách gel (phòng thí nghiệm sinh học-Rad, Hoa Kỳ).Cảm ứng chiến lượcPhương tiện được xác định (DM) cho các nền văn hóa bình lắc là bao gồm (g L-1) 10 glyxêrin, 15 K2HPO4, 7.5 KH2-PO4, 2.5 (NH4) 2SO4, 2 MgSO47H2O, 2 axít citric, và 1 mL của một giải pháp nguyên tố. Các nguyên tố giải pháp chứa (g L-1): 1.5 CaCl22H2O, 3.0 ZnSO4-7H2O, 2.8 CoSO47H2O, cách 0.2 CuCl22H2O, 2.0 MnCl2-4H2O, và 2.8 FeSO47H2O. DM được bổ sung 35 μg mL-1 kanamycin và 50 μg mL-1 chloramphenicol.