Pulverized rhizomes ofA. asphodeloi

Pulverized rhizomes of
A. asphodeloides
(1000 g) were
suspended in 60% aqueous acetone (2 L) for 3 days at room
temperature. After insoluble residues were removed, the
solvent was evaporated under reduced pressure to purge
acetone. The extracted material was collected by lyophilization.
The extracted material was dissolved in H
2
O (500 mL) and
extracted with two 500-mL portions of
n
-hexane (Hex), three
500-mL portions of ethyl acetate (EtOAc), and three 500-mL
portions of 1-butanol (BuOH). The evaporation of each fraction
resulted in the following amounts of dried matter 171.7 (H
2
O),
1.59 (Hex), 1.82 (EtOAc), and 2.69 g (BuOH). Among these
four fractions, the EtOAc fraction showed the highest anti-
fungal activity; therefore, this fraction was further purified
by the silica gel column chromatography (3.0

25 cm). When
the column was eluted with CHCl
3
-
EtOAc (20:1), three
distinct fractions (Fr-A, Fr-B, and Fr-C) were obtained. The
weight of each fraction was 64.2 (Fr-A), 70.0 (Fr-B), and 774.0
mg (Fr-C), respectively. Among these three fractions, Fr-B
showed the highest antifungal activity. When the Fr-B was
developed on a TLC plate with MeOH
-
CHCl
3
-
H
2
O (35:65:
10) and colorized with VS reagent, only one spot appeared at
R
f
0.7. Therefore, this fraction was applied on the reverse-
phase HPLC and eluted with H
2
O
-
CH
3
CN with its ratio being
varied from 68:32 to 29:71 during a 13-min elution at a flow
rate of 1.0 mL min
-
1
. Finally 40.7 mg of dried matter was
obtained as the purified matter.
Molecular Analysis Data of the Purified Matter.
[
R
]
D
-
134° (MeOH: c 0.47); IR
Ó
max
3350 cm
-
1
; EIMS:
m
/
z
)
252
(M
+
, 100%), 237 (38), 158 (83), 145 (77), 131 (66), 107 (90), 77
(36).
1
H NMR (CDCl
3
):
‰
7.19 (2H, d,
J
)
8.5 Hz, H-2
′
,6
′
), 7.12
(2H, d,
J
)
8.5 Hz, H-2
′′
,6
′′
), 6.81 (2H, d,
J
)
8.5 Hz, H-3
′
,5
′
),
6.80 (2H, d,
J
)
8.5 Hz, H-3
′′
,5
′′
), 6.54 (1H, d,
J
)
11.0 Hz,
H-1), 6.03 (1H, ddd,
J
)
6.0, 10.5, 16.5 Hz, H-4), 5.70 (1H, dd,
J
)
10.0, 11.0 Hz, H-2), 5.19 (1H, ddd,
J
)
1.5, 1.5, 16.5 Hz,
H-5), 5.18 (1H, ddd,
J
)
1.5, 1.5, 10.5 Hz, H-5), 4.89 (2H, br s,
exch. D
2
O, -OH), 4.51 (1H, dd,
J
)
6.0, 10.0 Hz, H-3).
13
C NMR
(125 MHz, CDCl
3
):
‰
154.4 (C-4
′
)
a
, 153.9 (C-4
′′
)
a
, 140.7 (C-4),
135.7 (C-1
′′
), 131.9 (C-2), 130,0 (C-2
′
,6
′
)
b
, 129.9 (C-1
′
), 128.9
(C-2
′′
,6
′′
)
b
, 128.6 (C-1), 115.4 (C-3
′′
,5
′′
)
c
, 115.1 (C-3
′
,5
′
)
c
, 115.0
(C-5), 46.8 (C-3). (The signals designated with the same letter
may be interchanged.)
MIC Determination of the Purified Matter.
To inves-
tigate the antifungal spectrum of the purified matter, its
minimum inhibitory concentration (MIC) against various fungi
was determined. The assay method was the microdilution
method described below.
Test fungi were inoculated on a potato dextrose agar (PDA)
medium (Difco, Detroit) and incubated at 28 °C for 1
-
2 weeks
until they formed a well-extended fungal mat with spores.
These spores were collected with 0.05% Tween 80 solution and
washed with sterile distilled water. The spores were suspended
in a Czapek dox broth medium (Difco) or a PDB medium
(Difco). The spore concentration was adjusted at 10
6
spores
mL
-
1
.
The purified matter was dissolved in DMSO (40 mg mL
-
1
)
and stored at
-
10 °C. Before use, this stock solution was
thawed and diluted with Czapek Dox broth medium to prepare
test solutions at prescribed concentrations. Initially, the stock
solution was 10-fold diluted, and then 2-fold dilution was
repeated. A 90-
Ì
L aliquot of each test solution was placed in
each well of a 96-well microplate (8 rows

12 columns, one
row per one strain of test fungus), and 10
Ì
L of a spore
suspension (10
6
spores mL
-
1
) of a test fungus was added to
each well. The final concentration of the purified matter in
those wells ranged from 400 to 6.3
Ì
gmL
-
1
. Column 1
contained the highest concentration, and column 7 contained
the lowest concentration. Columns 8 and 9 were used as
controls; column 8 contained Czapek dox broth medium

Kết quả (Việt) 1:

Pulverized thân rễ củaA. asphodeloides(1000 g)bị đình chỉ trong 60% dung dịch acetone (2 L) trong 3 ngày tại Phòngnhiệt độ. Sau khi hòa tan dư lượng đã được gỡ bỏ, cácdung môi đã bốc hơi dưới áp lực giảm để tẩyAcetone. Các tài liệu được trích xuất được thu thập bởi lyophilization.Các tài liệu được trích xuất được hòa tan trong H2O (500 mL) vàchiết xuất với hai phần 500 mLn-hexan (Hex), baphần 500 mL của etyl axetat (EtOAc), và ba 500-mLPhần 1-butanol (BuOH). Sự bay hơi của từng phầnkết quả là số tiền sau khô chất 171.7 (H2O),1,59 (hex), 1.82 (EtOAc) và 2.69 g (BuOH). Trong số nàybốn phân số, phần nhỏ EtOAc cho thấy cao nhất chống-nấm hoạt động; do đó, phần này được thêm tinh khiếtbởi silica gel cột sắc ký (3.025 cm). KhiCác cột được eluted với CHCl3-EtOAc (20:1), bakhác biệt với các phân số (Fr-A, Fr-B, và Fr-C) đã thu được. Cáctrọng lượng của mỗi phần là 64,2 (Fr-A), 70.0 (Fr-B), và 774.0MG (Fr-C), tương ứng. Trong số các phân số ba, Fr-Bcho thấy hoạt động chống nấm cao nhất. Khi Fr-B làphát triển trên một tấm TLC với MeOH-CHCl3-H2O (35:65:10) và colorized với VS tinh khiết, chỉ có một vị trí xuất hiện tạiRf0,7. vì vậy, phần này được áp dụng trên đảo ngược-giai đoạn HPLC và eluted với H2O-CH3CN với tỉ lệkhác nhau từ 68:32 để 29:71 trong elution 13-min tại một dòng chảytốc độ 1.0 mL min-1. Cuối cùng là 40,7 mg chất khôthu được như là vấn đề tinh khiết.Dữ liệu phân tích phân tử của vật chất tinh khiết.[R]D-134° (MeOH: c 0,47); HỒNG NGOẠIÓtối đa3350 cm-1; EIMS:m/z)252(M+100%), 237 (38), 158 (83), 145 (77), 131 (66), 107 (90), 77(36).1H NMR (CDCl3):‰7,19 (2H, d,J)8.5 Hz, H-2′, 6′), 7,12(2H, d,J)8.5 Hz, H-2′′, 6′′), 6.81 (2H, d,J)8.5 Hz, H-3′, 5′),6,80 (2H, d,J)8.5 Hz, H-3′′, 5′′), 6,54 (1H, d,J)11,0 Hz,H-1), 6,03 (1 H, ddd,J)6.0, 10,5, 16,5 Hz, H-4), 5,70 (1 H, dd,J)10,0, 11,0 Hz, H-2), 5.19 (1 H, ddd,J)1.5, 1,5, 16,5 Hz,H-5), 5,18 (1 H, ddd,J)1.5, 1,5, 10,5 Hz, H-5), 4,89 (2 H, br s,Exch. D2O, -OH), 4,51 (1 H, dd,J)6.0, 10,0 Hz, H-3).13C NMR(125 MHz, CDCl3):‰154.4 (C-4′)một, 153.9 (C-4′′)một, 140.7 (C-4),135.7 (C-1′′), 131.9 (C-2), 130,0 (C-2′, 6′)b, 129.9 (C-1′), 128.9(C-2′′, 6′′)b, LÀ 128.6 (C-1), 115.4 (C-3′′, 5′′)c, 115.1 (C-3′, 5′)c, 115.0(C-5), 46.8 (C-3). (Các tín hiệu tên cùng một lá thưcó thể được interchanged.)MIC các quyết định của vật chất tinh khiết.Inves-tigate kháng nấm phổ của các chất tinh khiết, của nónồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chống lại các loại nấmđã được xác định. Phương pháp khảo nghiệm là microdilutionphương pháp mô tả dưới đây.Kiểm tra nấm đã được tiêm chủng trên một khoai tây dextrose agar (PDA)Trung bình (Difco, Detroit) và ủ ở 28 ° C cho 1-2 tuầncho đến khi họ thành lập một mat nấm được mở rộng với các bào tử.Các bào tử được thu thập với giải pháp Tween 80 0,05% vàrửa sạch với nước cất vô trùng. Các bào tử bị đình chỉtrong một Czapek dox canh Trung (Difco) hay một phương tiện PDB(Difco). Nồng độ spore được điều chỉnh tại 106bào tửmL-1.Chất tinh khiết được hòa tan trong DMSO (40 mg mL-1)và được lưu trữ tại-10 ° C. Trước khi sử dụng, giải pháp cổ phiếu nàyxả đá và pha loãng với Czapek Dox canh vừa để chuẩn bịkiểm tra giải pháp ở nồng độ theo quy định. Ban đầu, các cổ phiếugiải pháp là 10-fold pha loãng, và sau đó pha loãng 2-foldlặp đi lặp lại. 90-ÌL aliquot của mỗi giải pháp kiểm tra đã được đặt trongmỗi cũng 96-cũng microplate (hàng 812 cột, mộthàng cho mỗi một trong những căng thẳng thử nghiệm nấm), và 10ÌL một sporeHệ thống treo (106bào tử mL-1) của một thử nghiệm nấm đã được thêm vàoVâng mỗi. Cuối cùng nồng độ chất tinh khiết trongnhững giếng dao động từ 400 đến 6.3ÌgmL-1. Cột 1chứa nồng độ cao nhất, và cột 7 chứanồng độ thấp nhất. Cột 8 và 9 được sử dụng nhưđiều khiển; cột 8 chứa Czapek dox canh vừa

Kết quả (Việt) 2:

Thân rễ nghiền thành bột của
A. asphodeloides
(1000 g) đã
bị đình chỉ trong 60% acetone dịch nước (2 lít) trong 3 ngày tại phòng
nhiệt độ. Sau khi dư lượng không hòa tan đã được gỡ bỏ, các
dung môi được bốc hơi dưới áp suất thấp để tẩy
acetone. Các nguyên liệu chiết xuất được thu thập bởi lyophilization.
Các nguyên liệu chiết xuất được hòa tan trong H
2
O (500 ml) và
chiết xuất với hai phần 500 ml
n
-hexane (Hex), ba
phần của ethyl acetate 500-mL (EtOAc), và ba 500-mL
phần 1-butanol (BuOH). Sự bay hơi của mỗi phần nhỏ
dẫn đến các khoản sau đây của khô vấn đề 171,7 (H
2
O),
1,59 (Hex), 1,82 (EtOAc), và 2,69 g (BuOH). Trong số những
bốn phân số, phần EtOAc cho thấy sự chống cao nhất
hoạt động của nấm; do đó, phần này được tiếp tục thanh lọc
bằng các phương pháp sắc ký cột silica gel (3.0
?
25 cm). Khi
cột được rửa giải với CHCl
3
-
EtOAc (20: 1), ba
phần riêng biệt (Fr-A, Cha-B, và Cha-C) thu được. Các
trọng lượng của mỗi phần là 64,2 (Fr-A), 70,0 (Fr-B), và 774,0
mg (Fr-C), tương ứng. Trong số ba phân số, Cha-B
cho thấy hoạt tính kháng nấm cao nhất. Khi Cha-B được
phát triển trên một tấm TLC với MeOH
-
CHCl
3
-
H
2
O (35:65:
10) và colorized với VS tinh khiết, chỉ có một chỗ xuất hiện tại
R
f
0.7. Do đó, phần này đã được áp dụng trên reverse-
giai đoạn HPLC và tách rửa với H
2
O
-
CH
3
CN với tỷ lệ của nó bị
thay đổi từ 68:32 đến 29:71 trong một rửa giải 13 phút ở một dòng chảy
tốc độ 1,0 mL min
-
1
. Cuối cùng 40,7 mg chất khô được
thu được là chất tinh khiết.
Phân tích phân tử dữ liệu của Matter tinh khiết.
[
R
]
D
-
134 ° (MeOH: c 0,47); IR
Ó
max
3350 cm
-
1
; EIMS:
m
/
z
)
252
(M
+
, 100%), 237 (38), 158 (83), 145 (77), 131 (66), 107 (90), 77
(36).
1
H NMR (CDCl
3
):
‰
7,19 (2H, d,
J
)
8,5 Hz, H-2
' ,
6
'
), 7,12
(2H, d,
J
)
8,5 Hz, H-2
'' ,
6
''
), 6,81 (2H, d,
J
)
8,5 Hz, H-3
' ,
5
'
),
6.80 (2H, d,
J
)
8,5 Hz, H-3
'' ,
5
''
), 6.54 (1H, d,
J
)
11.0 Hz,
H -1), 6.03 (1H, ddd,
J
)
6.0, 10.5, 16.5 Hz, H-4), 5,70 (1H, dd,
J
)
10,0, 11,0 Hz, H-2), 5.19 (1H, ddd,
J
)
1.5, 1.5, 16.5 Hz,
H-5), 5,18 (1H, ddd,
J
)
1.5, 1.5, 10.5 Hz, H-5), 4,89 (2H, br s,
Exch. D
2
O, -OH), 4,51 (1H, dd,
J
)
6,0, 10,0 Hz, H-3).
13
C NMR
(125 MHz, CDCl
3
):
‰
154,4 (4 C
'
)
một
, 153,9 (C-4
' '
)
một
, 140,7 ( C-4),
135,7 (C-1
''
), 131,9 (C-2), 130,0 (C-2
' ,
6
'
)
b
, 129,9 (C-1
'
), 128,9
(C-2
' '
6
''
)
b
, 128,6 (C-1), 115,4 (C-3
'' ,
5
''
)
c
, 115,1 (C-3
' ,
5
'
)
c
, 115.0
(C-5), 46,8 (C -3). (Các tín hiệu được chỉ định với cùng một lá thư
có thể được thay đổi cho nhau.)
Xác định MIC của Matter tinh khiết.
Để khối
tigate phổ kháng nấm của các chất tinh khiết, nó
nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) đối với các loại nấm khác nhau
đã được xác định. Các phương pháp khảo nghiệm đã được các pha loãng
phương pháp mô tả dưới đây.
Nấm thử nghiệm được tiêm vào một môi trường thạch đường khoai tây (PDA)
trung bình (Difco, Detroit) và ủ ở 28 ° C trong 1
-
2 tuần
cho đến khi họ thành lập một mat nấm cũng mở rộng với giao tử .
Những bào tử này đã được thu thập với 0,05% Tween 80 giải pháp và
rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Các bào tử đã bị đình chỉ
trong một Czapek DOX nước dùng vừa (Difco) hoặc một trung PDB
(Difco). Nồng độ bào tử đã được điều chỉnh ở mức 10
6
bào tử
ml
-
1
.
Các vấn đề tinh khiết được hòa tan trong DMSO (40 mg ml
-
1
)
và bảo quản ở
-
10 ° C. Trước khi sử dụng, dung dịch này được
tan ra và pha loãng với Czapek DOX trung nước dùng để chuẩn bị
các giải pháp thử nghiệm ở nồng độ quy định. Ban đầu, các chứng khoán
Giải pháp là 10 lần pha loãng, sau đó pha loãng 2 lần được
lặp đi lặp lại. Một 90-
Ì
L dịch chất của mỗi giải pháp thử nghiệm được đặt trong
mỗi giếng của microplate 96 giếng (8 hàng
?
12 cột, một
hàng cho mỗi một chủng thử nghiệm nấm), và 10
Ì
L của một bào tử
treo (10
6
bào tử ml
-
1
) của một loại nấm thử nghiệm đã được thêm vào
mỗi giếng. Các nồng độ cuối cùng của chất tinh khiết trong
những giếng dao động 400-6,3
Ì
GML
-
1
. Cột 1
chứa nồng độ cao nhất, và cột 7 chứa
nồng độ thấp nhất. Cột 8 và 9 đã được sử dụng như
điều khiển; Cột 8 chứa Czapek DOX vừa canh