The first real-time fluorescent pro

The first real-time fluorescent probes developed were 5
nuclease probes, which are commonly referred to by their
proprietary name, TaqMan probes (Fig. 1A). A TaqMan probe
is a short oligonucleotide (DNA) that contains a 5 fluorescent
dye and 3 quenching dye. To generate a light signal (i.e.,
remove the effects of the quenching dye on the fluorescent
dye), two events must occur. First, the probe must bind to a
complementary strand of DNA at 60°C. Second, at this temperature, Taq polymerase, the same enzyme used for the PCR,
must cleave the 5 end of the TaqMan probe (5 nuclease
activity), separating the fluorescent dye from the quenching dye.
A single TaqMan probe can be used for detection of amplified target DNA. If the intent of the assay is to differentiate a
single nucleotide polymorphism from a wild type sequence in
the target DNA, then a second probe with the complementary
nucleotide(s) to the polymorphism and a fluorescent dye with
a different emission spectrum is utilized. Thus, TaqMan probes
can be used to detect a specific, predefined polymorphism
under the probe in the PCR amplification product. For this
application, two reaction vessels are required, one with a complementary probe to detect wild-type target DNA and another
for detection of a specific nucleic acid sequence of a mutant
strain. Because TaqMan probes require 60°C for efficient 5
nuclease activity, the PCR is usually cycled between 95 and
60°C for amplification. In addition, the cleaved (free) fluorescent dye accumulates after each PCR temperature cycle, and
therefore can be measured at any time during the PCR cycling,
including the hybridization step. This is in contrast to molecular beacons and FRET hybridization probes, for which fluorescence can only be measured during the hybridization step

Kết quả (Việt) 2:

Các đầu dò huỳnh quang thời gian thực đầu tiên phát triển là 5?
Dò nuclease, thường được gọi bằng họ
tên độc quyền, thiết bị thăm dò TaqMan (Hình. 1A). Một thăm dò TaqMan
là một oligonucleotide ngắn (DNA) có chứa 5? huỳnh quang
nhuộm và 3? dập tắt thuốc nhuộm. Để tạo ra một tín hiệu ánh sáng (ví dụ,
loại bỏ ảnh hưởng của thuốc nhuộm dập tắt trên huỳnh quang
nhuộm), hai sự kiện phải xảy ra. Đầu tiên, tàu thăm dò phải ràng buộc vào một
sợi bổ sung của DNA ở 60 ° C. Thứ hai, ở nhiệt độ này, Taq polymerase, enzym được sử dụng cho PCR,
phải tách những 5? cuối của tàu thăm dò TaqMan (5 nuclease?
hoạt động), tách chất nhuộm huỳnh quang từ chất nhuộm dập tắt.
Một thăm dò TaqMan duy nhất có thể được sử dụng để phát hiện DNA mục tiêu khuếch đại. Nếu mục đích của thử nghiệm là để phân biệt một
đa hình nucleotide đơn từ một loại tự nhiên ở
các DNA mục tiêu, sau đó một tàu thăm dò thứ hai với những bổ sung
nucleotide (s) để các đa hình và một chất nhuộm huỳnh quang với
một quang phổ phát xạ khác nhau được sử dụng. Vì vậy, đầu dò TaqMan
có thể được sử dụng để phát hiện một cụ thể, đa hình được xác định trước
theo các thăm dò trong sản phẩm khuếch đại PCR. Đối với điều này
ứng dụng, hai tàu phản ứng được yêu cầu, một với một thăm dò bổ sung để phát hiện hoang dại đích DNA và một
phát hiện của một chuỗi acid nucleic cụ thể của một đột biến
căng thẳng. Bởi vì đầu dò TaqMan yêu cầu 60 ° C cho hiệu quả 5?
Hoạt động nuclease, PCR thường đạp xe từ 95 đến
60 ° C để khuếch đại. Ngoài ra, phân chia (miễn phí) thuốc nhuộm huỳnh quang tích lũy sau mỗi chu kỳ nhiệt độ PCR, và
do đó có thể được đo ở bất cứ lúc nào trong thời gian đi xe đạp PCR,
bao gồm các bước lai. Điều này trái ngược với các cảnh báo và phân tử probe băn khoăn, mà huỳnh quang chỉ có thể đo được trong bước lai