Bull Vet Inst Pulawy 50, 3-7, 2006D

Bull Vet Inst Pulawy 50, 3-7, 2006
DETECTION OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS
IN INFECTED CHICKEN EMBRYOS
AND CHICKEN TISSUES BY RT-PCR
KRZYSZTOF ŚMIETANKA, ZENON MINTA AND KATARZYNA DOMAŃSKA-BLICHARZ
Department of Poultry Diseases,
National Veterinary Research Institute, 24-100 Pulawy, Poland
e-mail: [e-mail]
Received for publication November 30, 2005.
Abstract
RT-PCR for the detection of Newcastle disease
virus (NDV) in allantoic fluids of SPF embryonated eggs as
well as in tissues of SPF chickens infected experimentally is
described. The method proved to be specific as all tested
NDVs were detected and no cross reaction with other RNA
viruses was observed. Sensitivity of the method was
established at 105ELD50/0.1 ml. To detect NDV in chicken
tissues, SPF chickens were inoculated with 106 EID50 of 3
NDV reference strains: La Sota (lentogenic), Roakin
(mesogenic) and Italy (velogenic pigeon variant) and 5 d p.i.
various tissue samples were aseptically collected followed by
RT-PCR and virus isolation on SPF embryos. The results
showed high concordance: 93% (La Sota and Italy) to 100%
(Roakin) between both methods.
Key words: chicken embryos, chickens,
Newcastle disease virus, RT-PCR.
Newcastle disease (ND) is a highly contagious
infection of poultry caused by avian paramyxovirus
serotype 1 (Newcastle disease virus, NDV). The disease
is spread worldwide affecting various species of poultry
and other birds (2, 3, 14). However, chickens appear to
be the most susceptible to the disease whereas aquatic
birds, including geese and ducks, are relatively resistant.
NDV differs in virulence and has been grouped into 5
pathotypes: velogenic viscerotropic, velogenic
neurotropic, mesogenic, lentogenic and asymptomatic. It
was shown that NDV virulence is dependent on the
amino acid sequence at the cleavage site of F0 gene. The
presence of multiple basic amino acids at the cleavage
site indicates that the virus isolate is pathogenic (2). In
diagnosis of Newcastle disease, methods recommended
by OIE Manual (16) and EU Council Directive (5)
comprise isolation on SPF embryonated eggs and
identification in the haemagglutination inhibition test.
Recently, as an alternative, OIE regulations have
proposed methods based on molecular biology (16).
Reverse transcription and polymerase chain reaction
(RT-PCR) methods are applied in many laboratories of
the world for the detection and identification of NDV
(1).
The aim of the present study was to apply RTPCR
for rapid detection of Newcastle disease virus in
experimentally infected chicken embryos and tissues of
chickens.
Material and Methods
Embryonated eggs. Specific pathogen free
(SPF) eggs were imported from Valo-Lohmann
(Germany).
Viruses. In the study 17 NDV strains were
used: 3 reference strains representing different
pathotypes: La Sota (lentogenic), Roakin (mesogenic)
and Italy (velogenic, pigeon variant) and 14 field strains
isolated in Poland from: chickens - Radom strain
isolated at the beginning of the 70-ties and 3 strains
isolated in 1990-2004, turkeys - 1 strain isolated in
2004, racing pigeons - 7 strains isolated at the late 80-
ties and beginning of the 90-ties, kindly provided by the
Department of Microbiology, Agricultural University in
Lublin, and feral pigeons - 2 strains recovered in 2002.
Prior to testing in RT-PCR, all the strains were
propagated on SPF embryonated eggs and allantoic fluid
was used for further studies.
Virus isolation assay. Virus isolation was
performed on 9-11 SPF embryonated eggs according to
the Annex III of the Council Directive 92/66/EEC (5).
Experimantel design. Three groups of four 4-
week-old SPF chickens kept in isolation were inoculated
intraocularly and intranasally with 106 EID50 of the
following strains of NDV: La Sota, Roakin and Italy.
Five days post inoculation (p.i.) tracheal and cloacal
swabs as well as samples from the trachea, lungs, liver,
spleen, heart, brain, kidneys, bursa of Fabricius,
duodenum, caecal tonsils, and rectum were aseptically
collected. Supernatants of the organs (used for viral
isolation as well as for RT-PCR) were prepared
according to the Annex III of the Council Directive
4
202 bp
92/66/EEC (5). Tracheal and cloacal swabs were
suspended in PBS with antibiotics (1 ml/swab) and after
1 h incubation at room temperature and centrifugation,
supernatants were harvested. All the supernatants were
pooled in batches of four. Additionally, pooled
supernatants of the trachea, lungs, liver, spleen, kidneys,
heart, and brain (pooled sample No. 1) and duodenum,
caecal tonsils, and rectum (pooled sample No. 2) were
also used as separate samples.
RNA isolation. RNA was isolated from
allantoic fluids using commercial RNeasy Mini Kit
(Qiagen, USA) as recommended by the supplier.
Reverse transcription (RT). cDNA was
synthesized using 5 μl of the total RNA, 4 μl of 5x first
strand buffer, 2 μl of 0.1 M DTT, 1 μl of ribonuclease
inhibitor (20 U/μl), 1 μl of 10mM dNTP, 1 μl (200 U)
of Super-Script II reverse transcriptase (Invitrogen,
USA), 0.5 μl of random hexamers (Promega, USA) in a
total volume of 20 μl for 50 min at 42°C.
Primers. A set of primers according to Creelan
et al. (6): NDV/F (5’ - GGT GAG TCT ATC CGG ARG
ATA CAA G – 3’) and NDV/R (5’ - TCA TTG GTT
GCR GCA ATG CTC T– 3’) that flanks the region
encompassing the cleavage site of the fusion protein
gene (F) was used in the study. The expected size of
PCR product was 202 bp. Oligonucleotides were
prepared in the Institute of Biochemistry and Biophysics
in Warsaw.
Polymerase chain reaction (PCR). PCR was
carried out in a total volume of 20 μl containing 2 μl of
cDNA, 2 μl of 10x PCR buffer, 0.5 μl of dNTP, 1.4 μl
of MgCl2 (25 mM), 0.5 μl of Taq polymerase
(Fermentas, Lithuania) and 1 μl of each primer. The
thermocycler conditions were as follows: 2 min at 94ºC
(initial denaturation), followed by 40 cycles of 15 s at
94ºC (denaturation), 30 s at 48ºC (annealing), 30 s at
72ºC (elongation). The PCR ended with a final
elongation for 7 min at 72ºC.
Detection of PCR products. PCR products
were separated in 1.5% agarose gel in 1 x TAE buffer
stained with ethidium bromide, compared with
molecular mass marker and visualized by ultraviolet
(UV) transillumination.
Sensitivity of RT-PCR. The sensitivity of the
RT-PCR was established by the ten-fold diluting of the
allantoic fluid containing lentogenic La Sota strain (108
ELD50/0.1 ml). Subsequently, RNA was isolated and
RT-PCR was performed according to the procedure
described above. The highest dilution with positive RTPCR
signal was determined.
Specificity of RT-PCR. To evaluate specificity
of the method, cDNA of the following RNA viruses was
used: paramyxovirus serotype 3, avian influenza virus
(H5N2 and H7N1), infectious bursal disease virus
(vaccinal 228E strain and very virulent 99/150 Polish
field strain), and avian infectious bronchitis virus
(strains M-41 and 4/91). PCR was performed according
to the protocol described above.
Results
All strains previously identified serologically as
NDV also tested positive in RT-PCR test with NDV
specific primers (Fig 1). No cross reaction was found
with other RNA viruses used in the study (data not
shown). Sensitivity of the RT-PCR has been established
at 105ELD50/0.1 ml (Fig. 2).
Table 1 shows the results of RT-PCR and virus
isolation performed on tissue samples collected from
SPF chickens 5 days p.i. By RT-PCR method the
positive results were obtained in all 13 tested samples
(13/13) p.i. with mesogenic Roakin strain, 11 samples
p.i. with velogenic Italy strain and 8 samples p.i. with
lentogenic LaSota strain. Positive result of virological
examination was noted in all samples (Roakin strain), 12
samples (Italy strain) and 10 samples (La Sota strain).
Both pooled samples (number 1 and 2) were positive in
RT-PCR and virus isolation (La Sota, Roakin and Italy
strains). Italy strain was isolated from all samples after
the first embryo passage. Isolation of Roakin strain
required one passage from all samples except for cloacal
and tracheal swabs. La Sota strain was isolated during
the first embryo passage only from the samples collected
from the respiratory tract, brain, bursa of Fabricius and
pooled sample 1. Concordance between RT-PCR and
virus isolation was: 93% (La Sota and Italy strains) and
100% (Roakin strain).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Fig. 1. Electrophoresis of RT-PCR products: M: marker Gene Ruler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Lithuania), Lane 1:
NDV/Radom/chicken/70; Lane 2: NDV/chicken/89/90; Lane 3: NDV/chicken/18/91; Lane 4: NDV/chicken/548/04; Lane 5:
NDV/pigeon/AR1; Lane 6: NDV/pigeon/AR2; Lane 7: NDV/pigeon/AR3; Lane 8: NDV/pigeon/AR4; Lane 9: NDV/pigeon/AR5;
Lane 10: NDV/pigeon/AR6; Lane 11: NDV/pigeon/AR7; Lane 12: NDV/pigeon/PW/46/02; Lane 13:NDV/pigeon/PW/166/02; Lane
14: NDV/turkey/549/04; Lane 15: NDV/LaSota; Lane 16: NDV/Roakin; Lane 17: NDV/Italy; Lane 18: negative control.
5
M 1 2 3 4 5 6 7
Fig.2. Sensitivity of RT-PCR: M: marker Gene Ruler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Lithuania); Lane 1: positive control; Lane 2:
107ELD50; Lane 3: 106ELD50; Lane 4: 105ELD50; Lane 5: 104 ELD50; Lane 6: 103 ELD50; Lane 7: 102 ELD50.
Table 1
Comparison of RT-PCR and virus isolation for the detection of NDV in tissues of infected chickens
Virus
La Sota strain Roakin strain Italy strain
Samples
Virus
isolation
Passage
RTPCR
Virus
isolation
Passage
RTPCR
Virus
isolation
Passage RTPCR
Cloacal
swabs
- - - + 2 + + 1 +
Tracheal
swabs
+ 1 + + 2 + + 1 +
Trachea +
1 + + 1 + + 1 +
Lungs +
1 + + 1 + + 1 +
Liver +
2 - + 1 + + 1 +
Spleen +
2 + + 1 + + 1 +
Heart -
- - + 1 + + 1 +
Brain +
1 + + 1 + + 1 +
Kidney +
2 + + 1 + + 1 +
Bursa of
Fabricius
+ 1 + + 1 + + 1 -
Duodenum +
2 + + 1 + - - -
Caecal
tonsils
- - - + 1 + + 1 +
Rectum - - -
+ 1 + + 1 +
Pooled
sample No. 1
+ 1 + + 1 + + 1 +
Pooled
sample No. 2
+ 2 + + 1 + + 1 +
202 bp
6
Discussion
As Newcastle disease is one of the most
important infectious diseases of poultry, rapid detecti

Kết quả (Việt) 1:

Bull Vet Inst Pulawy 50, 3-7, 2006CÁC PHÁT HIỆN CỦA NEWCASTLE BỆNH VIRUSIN NHIỄM GÀ PHÔIVÀ GÀ MÔ BỞI ĐẢNG CỘNG SẢN ROMANIA RTKRZYSZTOF ŚMIETANKA, ZENON MINTA VÀ KATARZYNA DOMAŃSKA-BLICHARZVùng chăn nuôi gia cầm bệnh,Viện nghiên cứu thú y quốc gia, 24-100 Pulawy, Ba Lanthư điện tử: [e-mail]ận được xuất bản ngày 30 tháng 11 năm 2005.Tóm tắtĐảng Cộng sản Romania RT để phát hiện bệnh Newcastlevirus (NDV) trong các chất dịch allantoic SPF embryonated trứng nhưcũng như trong các mô của SPF gà nhiễm bằng thực nghiệm làMô tả. Phương pháp được chứng minh là cụ thể là tất cả thử nghiệmNDVs được phát hiện và không có phản ứng chéo với RNAvirus được quan sát thấy. Độ nhạy cảm của phương pháp làđược thành lập tại 105ELD50/0.1 ml. Để phát hiện NDV ở gàmô, SPF gà đã được tiêm chủng với 106 EID50 3NDV tham khảo chủng: La Sota (lentogenic), Roakin(mesogenic) và ý (Phiên bản pigeon velogenic) và 5 d Pimẫu mô khác nhau đã được aseptically thu thập theoRT-Đảng Cộng sản Romania và virus cô lập trên SPF phôi. Kết quảcho thấy cao concordance: 93% (La Sota và ý) đến 100%(Roakin) giữa cả hai phương pháp.Từ khóa: phôi gà, gà,Newcastle bệnh virus, RT-Đảng Cộng sản Romania.Newcastle bệnh (ND) là rất dễ lâynhiễm trùng gây ra bởi paramyxovirus dịch cúm gia cầm chăn nuôi gia cầmserotype 1 (Newcastle bệnh virus, NDV). Bệnhlây lan trên toàn thế giới ảnh hưởng đến các loài gia cầmvà các loài chim khác (2, 3, 14). Tuy nhiên, gà xuất hiện đểđược đặt dễ bị bệnh trong khi thủy sảnchim, bao gồm cả ngỗng và vịt, là tương đối kháng.NDV khác ở virulence và đã được nhóm lại thành 5pathotypes: velogenic viscerotropic, velogenicneurotropic, mesogenic, lentogenic và không có triệu chứng. Nóđược chỉ ra rằng NDV virulence là phụ thuộc vào cácaxit amin tự tại địa điểm cát khai của F0 gen. Cácsự hiện diện của axit amin cơ bản nhiều tại cleavageTrang web chỉ ra rằng virus isolate gây bệnh (2). Ởchẩn đoán của Newcastle bệnh, phương pháp được đề nghịbởi OIE hướng dẫn sử dụng (16) và hội đồng EU chỉ thị (5)bao gồm sự cô lập SPF embryonated trứng vànhận dạng trong thử nghiệm sự ức chế haemagglutination.Gần đây, như là một thay thế, OIE quy định cóphương pháp được đề xuất dựa trên sinh học phân tử (16).Đảo ngược phiên âm và phản ứng chuỗi trùng hợp(RT-Đảng Cộng sản Romania) phương pháp được áp dụng trong phòng thí nghiệm nhiều củatrên thế giới để phát hiện và xác định NDV(1).Mục đích của nghiên cứu hiện nay là để áp dụng RTPCRđể nhanh chóng phát hiện vi-rút bệnh Newcastle trongthử nghiệm bị nhiễm gà phôi và các mô củacon gà.Vật liệu và phương phápEmbryonated trứng. Cụ thể mầm bệnh miễn phíQuả trứng (SPF) được nhập khẩu từ Valo-Lohmann(Đức).Vi-rút. Trong nghiên cứu 17 NDV chủng đãsử dụng: 3 tài liệu tham khảo chủng đại diện cho khác nhaupathotypes: La Sota (lentogenic), Roakin (mesogenic)và ý (velogenic, pigeon Phiên bản) và 14 trường chủngbị cô lập tại Ba Lan từ: gà - Radom căng thẳngbị cô lập ở đầu của 70-quan hệ và 3 chủngcô lập năm 1990-2004, gà tây - 1 căng thẳng được cô lập ởnăm 2004, đua chim bồ câu - 7 chủng bị cô lập tại 80 cuối-mối quan hệ và đầu trong số 90-, vui lòng cung cấp bởi cácVùng của vi sinh học, đại học nông nghiệp tạiLublin, và chim bồ câu hoang dã - 2 chủng phục hồi vào năm 2002.Trước khi thử nghiệm trong Đảng Cộng sản Romania RT, tất cả các chủng đãtuyên truyền trên SPF embryonated trứng và chất lỏng allantoicđược sử dụng để tiếp tục nghiên cứu.Khảo nghiệm virus bị cô lập. Cách ly vi rútthực hiện ngày 9-11 SPF embryonated trứng theophụ lục III của Hội đồng chỉ thị 92/66/EEC (5).Experimantel thiết kế. Ba nhóm của bốn 4-tuần tuổi SPF gà giữ trong sự cô lập được tiêm chủngintraocularly và intranasally với 106 EID50 của cáctheo chủng NDV: La Sota, Roakin và ý.Năm ngày đăng tiêm phòng (pi) sự và cloacalbệnh phẩm cũng như các mẫu từ khí quản, phổi, gan,lá lách, trái tim, não, thận, bursa của Fabricius,tá tràng, caecal amidan, và trực tràng là asepticallythu thập. Supernatants của các cơ quan (được sử dụng cho viruscô lập là tốt đối với Đảng Cộng sản Romania RT) đã được chuẩn bịtheo phụ lục III của Hội đồng chỉ thị4202 bp92/66/EEC (5). Sự và cloacal swabsbị đình chỉ trong PBS với thuốc kháng sinh (1 ml/tăm) và sau khi1giờ ấp trứng ở nhiệt độ phòng và số,supernatants đã được thu hoạch. Tất cả các supernatants đãgộp trong lô bốn. Ngoài ra, gộp lạisupernatants khí quản, phổi, gan, lá lách, thận,trái tim, và não (những mẫu số 1) và tá tràng,caecal amidan, và trực tràng (những mẫu số 2)cũng được sử dụng như mẫu riêng biệt.Cô lập RNA. RNA được cô lập từchất lỏng allantoic bằng cách sử dụng thương mại RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hoa Kỳ) theo khuyến cáo của các nhà cung cấp.Phiên mã ngược (RT). cDNA làTổng hợp bằng cách sử dụng 5 μl tất cả RNA μl 4 của 5 x đầu tiênStrand đệm, 2 μl 0.1 m DTT, 1 μl ribonucleasechất ức chế (20 U/μl), 1 μl 10mM dNTP, 1 μl (200 U)của kịch bản siêu II reverse transcriptase (Invitrogen,Hoa Kỳ), cách 0.5 μl ngẫu nhiên hexamers (Promega, Mỹ) trong mộtTổng khối lượng của 20 μl trong 50 phút tại 42° C.Chất nền, mồi. Một tập hợp các chất nền, mồi theo Creelanet al. (6): NDV/F (5' - GGT GAG TCT ATC CGG ARGATA CAA G-3') và NDV/R (5' - TCA TTG GTTGCR GCA ATG CTC T-3') mà cánh vùngbao gồm các trang web cát khai của phản ứng tổng hợp proteingen (F) được sử dụng trong nghiên cứu. Dự kiến kích thước củaĐảng Cộng sản Romania sản phẩm là 202 bp. Oligonucleotideschuẩn bị sẵn sàng trong viện hóa sinh và lý sinh họctại Warsaw.Phản ứng chuỗi polymerase (PCR). PCR làthực hiện trong một khối lượng tổng số 20 μl có 2 μl củacDNA, 2 μl 10 x PCR đệm, cách 0.5 μl dNTP, 1.4 μlcủa MgCl2 (25 mM), cách 0.5 μl Taq polymerase(Fermentas, Litva) và 1 μl của mỗi mồi. Cácthermocycler điều kiện đã như sau: 2 phút tại 94ºC(ban đầu denaturation), theo sau là các chu kỳ 40 15 s94ºC (denaturation), 30 s tại 48ºC (tôi), 30 s72ºC (kéo dài). Đảng Cộng sản Romania đã kết thúc với một trận chung kếtkéo dài trong 7 phút tại 72ºC.Phát hiện của Đảng Cộng sản Romania sản phẩm. Đảng Cộng sản Romania sản phẩmđã được tách ra trong 1,5% agarose gel trong 1 x TAE bộ đệmmàu với bromua ethidium, so vớiđiểm đánh dấu khối lượng phân tử và hình dung bởi tia cực tímTransillumination (UV).Độ nhạy của RT-Đảng Cộng sản Romania. Sự nhạy cảm của cácĐảng Cộng sản Romania RT được thành lập bởi ten-fold pha loãng của cácallantoic chất lỏng có chứa lentogenic La Sota căng thẳng (108ELD50/0.1 ml). Sau đó, RNA được cô lập vàRT-Đảng Cộng sản Romania được thực hiện theo các thủ tụcMô tả ở trên. Pha loãng cao nhất với RTPCR tích cựctín hiệu đã được xác định.Đặc trưng của RT-Đảng Cộng sản Romania. Để đánh giá đặc trưngtrong phương pháp, cDNA của các virus RNA sau làsử dụng: paramyxovirus serotype 3, vi rút cúm gia cầm(H5N2 và H7N1), bursal bệnh truyền nhiễm virus(vaccinal 228E căng thẳng và rất độc 99/150 đánh bónglĩnh vực căng thẳng), và viêm phế quản truyền nhiễm dịch cúm gia cầm virus(các dòng M-41 và 4/91). Đảng Cộng sản Romania được thực hiện theoĐối với giao thức mô tả ở trên.Kết quảTất cả các chủng trước đó xác định serologically làNDV cũng thử nghiệm tích cực trong Đảng Cộng sản Romania RT thử nghiệm với NDVcụ thể chất mồi (hình 1). Không có phản ứng chéo đã được tìm thấyvới các virus RNA được sử dụng trong nghiên cứu (dữ liệu khôngHiển thị). Độ nhạy của RT-PCR đã được thành lậptại 105ELD50/0.1 ml (hình 2).Bảng 1 cho thấy các kết quả của RT-Đảng Cộng sản Romania và viruscô lập thực hiện trên mẫu mô được thu thập từSPF gà 5 ngày Pi Bằng phương pháp Đảng Cộng sản Romania RT cáckết quả tích cực đã thu được trong tất cả các mẫu thử nghiệm 13Pi (13/13) với mesogenic Roakin căng, 11 mẫuPi với velogenic ý căng thẳng và 8 mẫu p.i. vớilentogenic LaSota căng thẳng. Các kết quả tích cực của virologicalkiểm tra đã được ghi nhận trong tất cả mẫu (Roakin căng thẳng), 12mẫu (ý căng thẳng) và 10 mẫu (La Sota căng thẳng).Cả hai gộp lại mẫu (số 1 và 2) đã được tích cực trongCô lập Đảng Cộng sản Romania RT và virus (La Sota, Roakin và ýchủng). Căng thẳng ý bị cô lập từ tất cả các mẫu sau khiCác đoạn văn đầu tiên của phôi thai. Sự cô lập của căng thẳng Roakinyêu cầu một đoạn từ tất cả các mẫu ngoại trừ cloacalvà sự swabs. La Sota căng thẳng là bị cô lập trongCác đoạn văn phôi đầu tiên chỉ từ mẫu thu thậptừ đường hô hấp, não, bursa của Fabricius vànhững mẫu 1. Concordance giữa Đảng Cộng sản Romania RT vàvirus bị cô lập là: 93% (La Sota và ý chủng) và100% (Roakin căng thẳng).M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18Hình 1. Điện của RT-PCR sản phẩm: M: đánh dấu gen người cai trị 100 bp bậc thang DNA (Fermentas, Litva), Lane 1:NDV/Radom/gà/70; Lane 2: NDV/gà/89/90; Lane 3: NDV/gà/18/91; Lane 4: NDV/gà/548/04; Lane 5:NDV/pigeon/AR1; Lane 6: NDV/pigeon/AR2; Lane 7: NDV/pigeon/AR3; Lane 8: NDV/pigeon/AR4; Lane 9: NDV/pigeon/AR5;Ngõ 10: NDV/pigeon/AR6; Lane 11: NDV/pigeon/AR7; Lane 12: NDV/pigeon/PW/46/02; Lane 13:NDV/pigeon/PW/166/02; Lane14: NDV/Thổ Nhĩ Kỳ/549/04; Lane 15: NDV/LaSota; Lane 16: NDV/Roakin; Lane 17: NDV/ý; Lane 18: kiểm soát tiêu cực.5M 1 2 3 4 5 6 7Fig.2. độ nhạy của RT-Đảng Cộng sản Romania: M: đánh dấu gen người cai trị 100 bp bậc thang DNA (Fermentas, Litva); Lane 1: tích cực kiểm soát; Lane 2:107ELD50; Lane 3: 106ELD50; Lane 4: 105ELD50; Lane 5:104 ELD50; Lane 6:103 ELD50; Lane 7:102 ELD50.Bảng 1So sánh RT-Đảng Cộng sản Romania và virus bị cô lập để phát hiện các NDV trong mô bị nhiễm bệnh con gàVirusLa Sota căng thẳng căng thẳng Roakin ý căng thẳngMẫuViruscô lậpĐoạn vănRTPCRViruscô lậpĐoạn vănRTPCRViruscô lậpThông qua RTPCRCloacalbệnh phẩm- - - + 2 + + 1 +Sựbệnh phẩm+ 1 + + 2 + + 1 +Khí quản +1 + + 1 + + 1 +Phổi +1 + + 1 + + 1 +Gan +2 - + 1 + + 1 +Lá lách +2 + + 1 + + 1 +Trái tim-- - + 1 + + 1 +Não +1 + + 1 + + 1 +Thận +2 + + 1 + + 1 +Bursa củaFabricius+ 1 + + 1 + + 1 -Thập nhị chỉ trường +2 + + 1 + - - -Caecalamidan- - - + 1 + + 1 +Trực tràng---+ 1 + + 1 +Gộp lạimẫu số 1+ 1 + + 1 + + 1 +Gộp lạimẫu số 2+ 2 + + 1 + + 1 +202 bp6Thảo luậnNhư Newcastle bệnh là một trong nhữngquan trọng các bệnh truyền nhiễm của gia cầm, nhanh chóng detecti

Kết quả (Việt) 2:

Bull Vet Inst Pulawy 50, 3-7, 2006
PHÁT HIỆN BỆNH VIRUS NEWCASTLE
các phôi gà NHIỄM
VÀ GÀ MÔ CỦA RT-PCR
Krzysztof ŚMIETANKA, Zenon Minta VÀ Katarzyna DOMAŃSKA-BLICHARZ
Sở bệnh gia cầm,
Viện Thú y Quốc gia, 24-100 Pulawy, Ba Lan
e-mail: [e-mail]
Nhận được công bố ngày 30 Tháng 11 năm 2005.
Tóm tắt
RT-PCR để phát hiện các bệnh Newcastle
virus (NDV) trong dịch allantoic trứng có phôi SPF như
cũng như trong các mô của SPF gà gây nhiễm thực nghiệm được
mô tả. Các phương pháp chứng minh được cụ thể như tất cả các thử nghiệm
đã được phát hiện và NDVs không có phản ứng chéo với các RNA khác
virus đã được quan sát. Độ nhạy của phương pháp này đã được
thành lập tại 105ELD50 / 0,1 ml. Để phát hiện trong thịt gà NDV
mô, gà SPF được tiêm 106 EID50 của 3
chủng tham khảo NDV: La Sota (lentogenic), Roakin
(mesogenic) và Ý (biến thể pigeon velogenic) và 5 d pi
mẫu mô khác nhau được thu thập một cách vô trùng theo sau
RT -PCR và phân lập virus trên phôi SPF. Các kết quả
cho thấy phù hợp cao: 93% (La Sota và Italy) đến 100%
(Roakin) giữa hai phương pháp.
Từ khóa: phôi gà, gà
. virus bệnh Newcastle, RT-PCR
bệnh Newcastle (ND) là một rất dễ lây
nhiễm gia cầm do paramyxovirus gia cầm
type huyết thanh 1 (virus bệnh Newcastle, NDV). Các bệnh
lây lan trên toàn thế giới đang ảnh hưởng đến các loài gia cầm
và chim khác (2, 3, 14). Tuy nhiên, gà xuất hiện để
được những người dễ bị bệnh trong khi thủy sản
các loài chim, bao gồm cả con ngỗng và vịt, là tương đối kháng.
NDV khác về độc tính và đã được nhóm lại thành 5
pathotypes: viscerotropic velogenic, velogenic
neurotropic, mesogenic, lentogenic và không có triệu chứng. Nó
đã được chứng minh rằng NDV độc lực phụ thuộc vào các
chuỗi axit amin ở vị trí phân cắt của gen F0. Các
hiện diện của nhiều axit amin cơ bản ở sự phân tách
trang web cho thấy chủng virus gây bệnh (2). Trong
chẩn đoán bệnh Newcastle, phương pháp khuyến khích
bằng tay OIE (16) và Chỉ thị của Hội đồng EU (5)
bao gồm phân lập trên SPF phôi trứng và
nhận dạng trong các thử nghiệm ức chế haemagglutination.
Gần đây, như một sự thay thế, các quy định của OIE đã
đề xuất phương pháp dựa trên sinh học phân tử (16).
Xếp chép và phản ứng chuỗi polymerase
(RT-PCR) phương pháp được áp dụng trong nhiều phòng thí nghiệm của
thế giới cho việc phát hiện và xác định các NDV
(1).
Mục đích của nghiên cứu này là để áp dụng RTPCR
để phát hiện nhanh chóng của Newcastle Virus bệnh trong
phôi gà gây nhiễm thực nghiệm và các mô của
gà.
Vật liệu và phương pháp
phôi trứng. Tác nhân gây bệnh cụ thể miễn phí
(SPF) trứng được nhập khẩu từ Valo-Lohmann
(Đức).
Virus. Trong nghiên cứu 17 chủng NDV được
sử dụng: 3 các chủng loại khác nhau đại diện cho
pathotypes: La Sota (lentogenic), Roakin (mesogenic)
và Ý (velogenic, chim bồ câu biến thể) và 14 chủng lĩnh vực
được phân lập tại Ba Lan từ: Gà - Radom chủng
phân lập tại bắt đầu của 70-quan hệ và 3 chủng
phân lập tại 1990-2004, gà tây - 1 chủng phân lập tại
năm 2004, chim bồ câu đua - 7 chủng tại 80- muộn
quan hệ và đầu 90-quan hệ, vui lòng cung cấp bởi
Sở Vi sinh vật , Đại học Nông nghiệp tại
Lublin, và bồ câu hoang dã -. 2 chủng phục hồi trong năm 2002
Trước khi thử nghiệm RT-PCR, tất cả các chủng này được
truyền vào trứng SPF có phôi và chất lỏng allantoic
đã được sử dụng để nghiên cứu thêm.
Phân lập virus khảo nghiệm. Phân lập virus đã được
thực hiện trên 9-11 trứng có phôi SPF theo
Phụ lục III của Hội đồng Chỉ thị 92/66 / EEC (5).
Experimantel thiết kế. Ba nhóm bốn 4-
gà SPF tuần tuổi lưu giữ trong sự cô lập được tiêm
intraocularly và đường mũi với 106 EID50 của
chủng sau của NDV:. La Sota, Roakin và Ý
Năm ngày sau tiêm (pi) khí quản và ổ nhớp
gạc cũng như mẫu từ khí quản, phổi, gan,
lá lách, tim, não, thận, bursa của Fabricius,
tá tràng, amidan manh tràng, trực tràng và đã được vô trùng
thu thập được. Supernatants của các cơ quan (được sử dụng cho virus
phân lập cũng như cho RT-PCR) đã được chuẩn bị
theo Phụ lục III của Hội đồng Chỉ thị
4
202 bp
92/66 / EEC (5). Khí quản và ổ nhớp gạc được
treo lơ lửng trong PBS với kháng sinh (1 ml / tăm bông) và sau
1 h ủ ở nhiệt độ phòng và ly tâm,
nước nổi đã được thu hoạch. Tất cả các nước nổi đã được
gộp lại trong đợt bốn. Ngoài ra, gộp
nổi của khí quản, phổi, gan, lá lách, thận,
tim và não (gộp mẫu số 1) và tá tràng,
amidan manh tràng, trực tràng (gộp mẫu số 2) đã được
sử dụng cũng như các mẫu riêng biệt.
RNA cô lập. RNA được phân lập từ
dịch allantoic sử dụng thương mại Kit RNeasy Mini
(Qiagen, USA) theo khuyến cáo của nhà cung cấp.
Xếp phiên mã (RT). cDNA được
tổng hợp sử dụng 5 ml tổng RNA, 4 ml 5x đầu tiên
đệm sợi, 2 ml 0,1 M DTT, 1 ml ribonuclease
inhibitor (20 U / ml), 1 ml 10mM dNTP, 1 ml (200 U)
Super-Script II reverse transcriptase (Invitrogen,
USA), 0,5 ml hexamers ngẫu nhiên (Promega, Mỹ) trong một
tổng thể tích 20 ml cho 50 phút ở 42 ° C.
mồi. Một tập hợp các đoạn mồi theo Creelan
et al. (6): NDV / F (5 '- GGT GAG TCT ATC CGG ARG
ATA CAA G - 3 ') và NDV / R (5' - TCA TTG GTT
GCR GCA ATG CTC T- 3 ') là hai cánh khu vực
bao gồm các trí phân cắt của protein dung hợp
gen (F) được sử dụng trong nghiên cứu. Các kích thước dự kiến của
sản phẩm PCR là 202 bp. Oligonucleotide được
chuẩn bị ở Viện Hóa sinh và Lý sinh học
tại Warsaw.
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR). PCR được
thực hiện trong một tổng thể tích 20 ml có chứa 2 ml
cDNA, 2 ml 10x đệm PCR, 0,5 ml dNTP, 1,4 ml
của MgCl2 (25 mM), 0,5 ml của Taq polymerase
(Fermentas, Lithuania) và 1 ml mỗi mồi. Các
điều kiện thermocycler như sau: 2 phút ở 94ºC
(biến tính ban đầu), tiếp theo là 40 chu kỳ của 15 s tại
94ºC (biến tính), 30 s tại 48ºC (ủ), 30 s tại
72ºC (kéo dài). Các PCR đã kết thúc với một trận chung kết
kéo dài trong 7 phút ở 72ºC.
Phát hiện sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR
đã được tách ra ở 1,5% agarose gel trong 1 x TAE đệm
nhuộm với ethidium bromide, so với
marker phân tử lượng và hình dung bằng tia cực tím
(UV) transillumination.
Độ nhạy của RT-PCR. Độ nhạy của
RT-PCR được thành lập bởi các pha loãng gấp mười lần các
chất lỏng có chứa allantoic lentogenic La Sota giống (108
ELD50 / 0,1 ml). Sau đó, RNA được cô lập và
RT-PCR được thực hiện theo các thủ tục
được mô tả ở trên. Các pha loãng cao nhất với RTPCR tích cực
tín hiệu đã được xác định.
đặc của RT-PCR. Để đánh giá độ đặc
của phương pháp, cDNA của virus RNA sau đây được
sử dụng: type huyết thanh paramyxovirus 3, virus cúm gia cầm
(H5N2 và H7N1), virus bệnh truyền nhiễm bursal
(chủng 228E vaccinal và rất nguy hiểm 99/150 Ba Lan
căng thẳng trường) và gia cầm viêm phế quản truyền nhiễm
(chủng M-41 và 4/91). PCR được thực hiện theo
để các giao thức được mô tả ở trên.
Kết quả
Tất cả các chủng huyết thanh xác định trước đó như
NDV cũng đã thử nghiệm dương tính trong xét nghiệm RT-PCR với NDV
cặp mồi đặc hiệu (Hình 1). Không có phản ứng chéo đã được tìm thấy
với virus RNA khác được sử dụng trong nghiên cứu này (dữ liệu không
hiển thị). Độ nhạy của RT-PCR đã được thành lập
tại 105ELD50 / 0,1 ml (Fig. 2).
Bảng 1 cho thấy các kết quả của RT-PCR và virus
phân lập được thực hiện trên các mẫu mô lấy từ
SPF gà 5 ngày pi Bằng phương pháp RT-PCR sự
tích cực kết quả thu được trong tất cả 13 mẫu thử nghiệm
(13/13) pi với mesogenic căng Roakin, 11 mẫu
pi với velogenic Ý căng thẳng và 8 mẫu pi với
lentogenic căng LaSota. Kết quả tích cực của virus
, kiểm tra được ghi nhận trong tất cả các mẫu (Roakin căng), 12
mẫu (Italy căng) và 10 mẫu (La Sota căng).
Cả hai mẫu gộp (số 1 và 2) là tích cực trong
RT-PCR và phân lập virus (La Sota, Roakin và Ý
chủng). Ý chủng được phân lập từ các mẫu vật sau khi
đoạn phôi thai đầu tiên. Phân lập Roakin căng
cần một đoạn từ tất cả các mẫu trừ ổ nhớp
gạc và khí quản. La Sota chủng được phân lập trong
đoạn phôi thai đầu tiên chỉ từ các mẫu thu thập
từ đường hô hấp, não, bursa của Fabricius và
gộp mẫu 1. Concordance giữa RT-PCR và
phân lập virus là: 93% (chủng La Sota và Italy) và
100% (Roakin căng).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Hình. 1. Điện di sản phẩm RT-PCR: M: marker Gene Thước 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Lithuania), Ngõ 1:
NDV / Radom / gà / 70; Ngõ 2: NDV / gà / 89/90; Ngõ 3: NDV / gà / 18/91; Ngõ 4: NDV / gà / 548/04; Ngõ 5:
NDV / pigeon / AR1; Ngõ 6: NDV / pigeon / AR2; Ngõ 7: NDV / pigeon / AR3; Ngõ 8: NDV / pigeon / AR4; Ngõ 9: NDV / pigeon / AR5;
Ngõ 10: NDV / pigeon / AR6; Ngõ 11: NDV / pigeon / AR7; Ngõ 12: NDV / pigeon / PW / 46/02; Ngõ 13: NDV / pigeon / PW / 166/02; Ngõ
14: NDV / gà tây / 549/04; Ngõ 15: NDV / LaSota; Ngõ 16: NDV / Roakin; Ngõ 17: NDV / Italy; Ngõ 18: kiểm soát tiêu cực.
5
M 1 2 3 4 5 6 7
Hình 2. Độ nhạy của RT-PCR: M: marker Gene Thước 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Lithuania); Ngõ 1: kiểm soát tích cực; Ngõ 2:
107ELD50; Ngõ 3: 106ELD50; Ngõ 4: 105ELD50; Ngõ 5: 104 ELD50; Ngõ 6: 103 ELD50; Ngõ 7: 102 ELD50.
Bảng 1
so sánh của RT-PCR và phân lập virus để phát hiện các NDV trong các mô của bệnh gà
Virus
La Sota căng Roakin căng Ý căng
Mẫu
Virus
ly
Passage
RTPCR
Virus
ly
Passage
RTPCR
Virus
ly
Passage RTPCR
ổ nhớp
gạc
- - - + 2 + 1 + +
khí quản
bệnh phẩm
+ 1 + 2 + + + 1 +
khí quản +
1 + 1 + + + 1 +
Phổi +
1 + 1 + + + 1 +
gan +
2 - + 1 + 1 + +
Lách +
2 + 1 + + + + 1
Heart -
- - + 1 + 1 + +
Brain +
1 + 1 + + + 1 +
Thận +
2 + 1 + + + 1 +
Bursa của
Fabricius
+ 1 + 1 + + + 1 -
tá tràng +
2 + 1 + + - - -
manh tràng
amidan
- - - + 1 + 1 + +
trực tràng - - -
+ 1 + 1 + +
Pooled
mẫu số 1
+ 1 + 1 + + + 1 +
Pooled
mẫu số 2
+ 2 + 1 + + + 1 +
202 bp
6
Thảo luận
Khi bệnh Newcastle là một trong những hầu hết
các bệnh truyền nhiễm quan trọng của gia cầm, detecti nhanh