Neutrophils (1310 cells / ml) were

Neutrophils (1
3
10 cells / ml) were incubated in 1 ml of KRP containing 1
mmol / l CaCl , 10 mmol / l glucose and 0–100 mmol / l of timosaponins E1 and
2
E2 for 3 min at 37
8
C, and then 0.5 ml of ice-cold 45% trichloroacetic acid (final
concentration, 15%) containing 1 mmol / l sodium vanadate and 2 mmol / l
phenylmethylsulfonylfluoride was added to stop the reaction. After incubation
for 30 min at 4
8
C, the mixture was centrifuged at 10,000
g
for 15 min at 4
8
C.
The precipitate was washed twice with ice-cold diethyl ether–ethanol (1:1, v / v),
dissolved in 50 ml of 62.5 mmol / l Tris–HCl (pH 6.8) containing 2% sodium
dodecyl sulfate (SDS), 0.7 mol / l
b
-mercaptoethanol and 10% glycerol and was
subjected to SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE) using a
7.5% gel [24]. The electrophoresed proteins were transferred onto Immobilon-P
membranes (Nippon Millipore) using a semidry blotting apparatus (Sartorius)
2
for 60 min at 2 mA / cm , and the tyrosyl phosphorylated proteins were detected
using phosphotyrosine-specific monoclonal antibody (PY-20; ICN Biochemi-cals), peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse immunoglobulin G antibody (E.Y.
Laboratories) and the ECL Western Blotting Detection System (Amersham,
Japan) [21].
The apparent molecular masses of the proteins were determined using
prestained molecular weight standards (14,300–200,000 molecular weight
range; Gibco–BRL). To estimate the phosphorylation level, the lanes were
scanned using an Epson GT 8000 (Seiko Epson Co., Japan) and the intensity of
the 58 kDa band was analysed using NIH Image software (Nayne Rasband,
National Institute of Health, USA)

Kết quả (Việt) 1:

Bạch cầu trung tính (1310 các tế bào / ml) đã được ủ trong 1 ml chứa 1 KRPmmol / l CaCl, 10 mmol / l glucose và 0-100 mmol / l timosaponins E1 và2E2 trong 3 phút ở 378C, và sau đó cách 0.5 ml lạnh 45% Axit tricloaxetic (trận chung kếtnồng độ, 15%) có chứa 1 mmol / l natri vanadat và 2 mmol / lphenylmethylsulfonylfluoride đã được bổ sung để ngăn chặn các phản ứng. Sau khi ủtrong 30 phút tại 48C, hỗn hợp được ly tại 10.000gcho 15 phút ở 48C.Precipitate đã được rửa sạch hai lần với lạnh dietyl ete-ethanol (1:1, v / v),hòa tan trong 50 ml 62.5 mmol / l Tris-HCl (pH 6.8) chứa 2% natridodecyl sulfat (SDS), cách 0.7 mol / lbNhóm glycerol - mercaptoethanol và 10% vàđối tượng dùng mũi SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-trang) bằng cách sử dụng một7,5% gel [24]. Các protein electrophoresed được chuyển vào Immobilon-Pmàng tế bào (Nippon Millipore) bằng cách sử dụng một bộ máy nên thấm (Sartorius)2trong 60 phút tại 2 mA / cm và protein tyrosyl phosphorylated đã được phát hiệnbằng cách sử dụng cụ thể phosphotyrosine monoclonal kháng (PY-20; ICN Biochemi-Cal), kháng thể peroxidase kết thỏ chống chuột globulin miễn dịch G (E.Y.Phòng thí nghiệm) và phương Tây ECL thấm hệ thống phát hiện (Amersham,Nhật bản) [21].Khối lượng phân tử rõ ràng của các protein đã được xác định bằng cách sử dụngtrọng lượng phân tử prestained tiêu chuẩn (trọng lượng phân tử 14,300-200.000phạm vi; Gibco–BRL). Để ước lượng mức độ phosphorylation, các tuyến đường đãquét bằng cách sử dụng một Epson GT 8000 (Seiko Epson Co., Nhật bản) và cường độBan nhạc 58 kDa được phân tích bằng cách sử dụng phần mềm hình ảnh NIH (Nayne Rasband,Viện quốc gia sức khỏe, Hoa Kỳ)

Kết quả (Việt) 2:

Bạch cầu trung tính (1
3
10 tế bào / ml) được ủ trong 1 ml KRP chứa 1
mmol / l CaCl, 10 mmol / l glucose và 0-100 mmol / l của timosaponins E1 và
2
E2 trong 3 phút ở 37
8
C, và sau đó 0,5 ml 45% axit băng lạnh tricloaxetic (thức
tập trung, 15%) có chứa 1 mmol / l natri vanadate và 2 mmol / l
phenylmethylsulfonylfluoride đã được bổ sung để ngăn chặn các phản ứng. Sau khi ủ
trong 30 phút ở 4
8
C, hỗn hợp được ly tâm ở 10.000
g
trong 15 phút ở 4
8
C.
Kết tủa được rửa sạch hai lần với nước đá lạnh diethyl ether-ethanol (1: 1, v / v),
hòa tan trong 50 ml 62,5 mmol / l Tris-HCl (pH 6.8) có chứa 2% sodium
dodecyl sulfate (SDS), 0,7 mol / l
b
-mercaptoethanol và glycerol 10% và đã được
chịu SDS-polyacrylamide gel điện (SDS-PAGE) sử dụng một
7,5% gel [24]. Các protein electrophoresed đã được chuyển lên Immobilon-P
màng (Nippon Millipore) sử dụng một thiết bị thấm semidry (Sartorius)
2
cho 60 phút ở 2 mA / cm, và các protein phosphoryl tyrosyl đã được phát hiện
sử dụng pyruvate cụ thể kháng thể đơn dòng (PY-20; ICN Biochemi-CALS), peroxidase liên hợp thỏ chống chuột immunoglobulin G kháng thể (EY
Laboratories) và ECL Tây Blotting Detection System (Amersham,
Nhật Bản) [21].
các khối lượng phân tử biểu của các protein được xác định bằng
các tiêu chuẩn trọng lượng phân tử prestained (14,300-200,000 trọng lượng phân tử
khoảng; Gibco-BRL). Để ước tính mức độ phosphoryl hóa, làn đường đã được
quét bằng một Epson GT 8000 (Seiko Epson Công ty Nhật Bản) và cường độ của
các ban nhạc 58 kDa được phân tích bằng phần mềm NIH Image (Nayne Rasband,
Viện Y tế Quốc gia, Mỹ)