imum of 0.9 mg of total DNA per rea

imum of 0.9 mg of total DNA per reaction).
The aqueous phase was overlaid with 2–3 drops
of mineral oil (Sigma-Aldrich). The 30 ampli-
fication cycles included denaturation at 94 C
for 45 sec, annealing at 62 C for 1 min, and
synthesis at 72 C for 1 min. After the last cycle,
the tubes were kept at 72 C for 10 min to complete
the extension, and mixtures were cooled
to 4 C. From the first PCR product, 1 ml was
transferred into the second reaction. Except for
modifications in the concentration of MgCl2 (3
ml of 25 mM) and the annealing temperature
(64 C), the previously described PCR protocol
was followed. For the second round, 62–64 C
annealing temperatures seemed to be optimal;
we selected the higher temperature to increase
specificity. DNA extracted from purified
BoHV-2 and distilled water served as positive
and negative controls. The optimal annealing
temperature (62 and 64 C) was determined by
gradient PCR in Tgradient Whatman Biometra
device (Analytik GmbH, Goettingen, Germany).
For further optimization, the PCR assay
was analyzed by a PCR Optimization Kit II
(Sigma-Aldrich).
The PCR products were analyzed by electrophoresis
in 2% agarose gels using 0.53 Tris-borate-ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA)
running buffer. Ethidium bromide-stained
bands were visualized with ultraviolet (UV)
light and recorded with a video camera (Kodak
EDAS 290, Hemel, Hempstead, UK). The molecular
sizes of fragments were compared with
those of a GeneRulery 100-bp ladder (Fermentas
AB, Vilnius, Lithuania).
Specificity of the assay was checked against
11 animal and human herpesviruses (BoHV-1,
-2 [Allerton strain] -4, -5, AlHV-1, equid herpesvirus
1, -2, -5, suid herpesvirus 1, murid
herpesvirus 1, human herpesvirus 4). Bovine
cell genome was also tested using the MadinDarby
bovine kidney cell line. Sensitivity studies
were carried out by determining PCR detection
limits from various dilutions of titrated
BoHV-2 Allerton strain (100, 10, and 1 plaque
forming units [pfu] per reaction). All PCR assays
were carried out using previously reported
precautions to prevent cross-contamination
(Bela´k and Ballagi-Porda´ny, 1993). To confirm
the specificity of results, one positive field sample,
representing each detected virus, was selected
for sequencing. The sequences were
aligned with the corresponding viral sequences
of the data bank by the program BLASTN 2.2.7
(Altschul et al., 1997)

Kết quả (Việt) 1:

imum của 0,9 mg của tất cả các DNA cho một phản ứng).Giai đoạn dung dịch nước được che với 2-3 giọtkhoáng sản dầu (Sigma-Aldrich). Các ampli 30-fication chu kỳ bao gồm denaturation tại 94 Ctrong 45 giây, làm cho deo ở 62 C cho 1 phút, vàTổng hợp tại 72 C cho 1 phút. Sau khi chu kỳ cuối,Các ống được giữ tại 72 C cho 10 phút để hoàn thànhTiện ích mở rộng, và hỗn hợp được làm mát bằngđến 4 C. Từ các sản phẩm đầu tiên của Đảng Cộng sản Romania, 1 ml làchuyển vào phản ứng thứ hai. Ngoại trừ choSửa đổi trong nồng độ của MgCl2 (3ml của 25 mM) và nhiệt độ tôi(64 C), giao thức mô tả trước đó của Đảng Cộng sản Romaniasau đó. Vòng thứ hai, 62-64 Cdường như làm cho deo nhiệt độ là tối ưu;chúng tôi lựa chọn nhiệt độ cao để tăngđặc trưng. DNA chiết xuất từ tinh khiếtBoHV-2 và chưng cất nước phục vụ như tích cựcvà tiêu cực điều khiển. Tôi hoàn tối ưunhiệt độ (62 và 64 C) đã được xác định bởiĐảng Cộng sản Romania gradient trong Tgradient tráng nhựa Whatman Biometrathiết bị (Analytik GmbH, Goettingen, Đức).Để tiếp tục tối ưu hóa, các khảo nghiệm PCRđược phân tích bởi một đảng Cộng sản Romania tối ưu hóa Kit II(Sigma-Aldrich).Các sản phẩm PCR được phân tích bằng điệntrong 2% agarose gel sử dụng 0,53 Tris-borat-ethylenediaminetetraaceticacid (EDTA)chạy bộ đệm. Ethidium bromua-màu.Ban nhạc được hình dung với tia cực tím (UV)ánh sáng và được ghi nhận với một máy quay video (KodakEDAS 290, Hemel, Hempstead, Vương Quốc Anh). Các phân tửKích thước của mảnh vỡ đã được so vớinhững người trong một cái thang 100 bp GeneRulery (FermentasAB, Vilnius, Litva).Đặc trưng của các khảo nghiệm đã được kiểm tra đối với11 động vật và con người herpesviruses (BoHV-1,-2 [Allerton căng thẳng] -4, -5, AlHV-1, equid herpesvirus1 -2, -5, suid herpesvirus 1, muridherpesvirus 1, con người herpesvirus 4). Bòbộ gen di động cũng đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng MadinDarbybò thận dòng tế bào. Nghiên cứu độ nhạyđã được thực hiện bằng cách xác định phát hiện Đảng Cộng sản Romaniagiới hạn từ dilutions khác nhau của chuẩn độBoHV-2 Allerton căng thẳng (100, 10, và 1 tấm««Các đơn vị [pfu] một phản ứng tạo thành). Tất cả Đảng Cộng sản Romania thử nghiệmđược thực hiện bằng cách sử dụng báo cáo trước đóbiện pháp phòng ngừa để ngăn ngừa ô nhiễm chéo(Bela´k và Ballagi-Porda´ny, 1993). Để xác nhậnCác đặc trưng của kết quả, một trong những lĩnh vực tích cực mẫu,đại diện cho mỗi virus phát hiện, đã được lựa chọnĐối với trình tự. Các chuỗi đãliên kết với các chuỗi virus tương ứngNgân hàng dữ liệu của chương trình BLASTN 2.2.7(Altschul và ctv., 1997)

Kết quả (Việt) 2:

imum 0,9 mg tổng DNA mỗi phản ứng).
Dung dịch nước đã được che phủ với 2-3 giọt
dầu khoáng (Sigma-Aldrich). 30 AMPLI
chu kỳ fication bao gồm biến tính ở 94 C
trong 45 giây, ủ ở 62 C trong 1 phút, và
tổng hợp ở 72 C trong 1 phút. Sau chu kỳ cuối cùng,
các ống được giữ ở 72 C trong 10 phút để hoàn thành
phần mở rộng, và hỗn hợp được làm lạnh
đến 4 C. Từ sản phẩm PCR đầu tiên, 1 ml được
chuyển vào các phản ứng thứ hai. Ngoại trừ
những thay đổi trong nồng độ của MgCl2 (3
ml 25 mM) và nhiệt độ ủ
(64 C), các giao thức PCR mô tả trước đây
đã được theo sau. Cho vòng thứ hai, 62-64 C
nhiệt độ ủ dường như được tối ưu;
chúng tôi chọn nhiệt độ cao hơn để tăng
tính đặc hiệu. DNA chiết xuất từ tinh khiết
BoHV-2 và nước cất phục vụ như là tích cực
kiểm soát và tiêu cực. Việc ủ tối ưu
nhiệt độ (62 và 64 C) được xác định bởi
độ dốc PCR trong Tgradient Whatman Biometra
thiết bị (Analytik GmbH, Goettingen, Đức).
Để tối ưu hóa hơn nữa, các xét nghiệm PCR
được phân tích bằng phương pháp PCR Optimization Kit II
(Sigma-Aldrich).
Các sản phẩm PCR được phân tích bằng điện
trong 2% gel agarose bằng 0,53 Tris-borate-ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA)
chạy đệm. Ethidium bromide nhuốm
ban nhạc này đã hình tượng với tia cực tím (UV)
ánh sáng và ghi lại với một máy quay phim (Kodak
EDA 290, Hemel, Hempstead, Vương quốc Anh). Các phân tử
kích thước của các mảnh vỡ được so sánh với
những người của một GeneRulery thang 100-bp (Fermentas
AB, Vilnius, Lithuania).
đặc của thử nghiệm đã được kiểm tra đối với
11 động vật và con người herpesviruses (BoHV-1,
-2 [Allerton căng] -4 , -5, AlHV-1, herpesvirus equid
1, -2, -5, herpesvirus suid 1, murid
herpesvirus 1, herpesvirus nhân 4). Bò
gen của tế bào cũng đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng MadinDarby
dòng tế bào thận bò. Nghiên cứu nhạy cảm
đã được thực hiện bằng cách xác định PCR phát hiện
giới hạn từ pha loãng khác nhau của chuẩn độ
BoHV-2 Allerton căng thẳng (100, 10, và 1 mảng bám
hình thành các đơn vị [PFU] mỗi phản ứng). Tất cả các xét nghiệm PCR
được thực hiện bằng cách sử dụng báo cáo trước
pháp phòng ngừa để ngăn ngừa lây nhiễm chéo
(Bela'k và Ballagi-Porda'ny, 1993). Để xác nhận
các đặc trưng của kết quả, một mẫu trường tích cực,
đại diện cho mỗi loại virus phát hiện, đã được lựa chọn
để sắp xếp. Các trình tự đã được
liên kết với các chuỗi virus tương ứng
của các ngân hàng dữ liệu của chương trình blastn 2.2.7
(Altschul et al., 1997)