(iii) Use reporter genes, either as

(iii) Use reporter genes, either as a translational fusion between the
reporter and the coding sequence for the enzyme or as a
transcriptional fusion between the reporter and the promoter for
the enzyme.
(iv) Use bioinformatic analysis of the predicted amino acid sequence
of the protein to identify putative targeting sequences, and infer
from those where in the cell the protein is located.
(d) Bioinformatic analysis predicts that the protein is located in the
chloroplast. You would like to make radioabelled protein to see
whether it can be imported into isolated chloroplasts.
You clone the cDNA into a vector allowing transcription in vitro
using a suitable RNA polymerase. After transcription in vitro, the RNA
is translated in vitro in the presence of one or more radioactively
labelled amino acids, using a suitable protein synthesis system, such as
a wheat-germ extract. The protein can then be tested for import into
chloroplasts. Note that it would be important to use a full-length (or
nearly full-length) cDNA for these experiments, so that any N-terminal
targeting information in the protein would be likely to be intact.
(Remember that you could also use a translational fusion to a reporter
gene to test subcellular location, as outlined in (c) (iii) above.)
(e) You argue that an important crop plant you are studying (but for
which there is no complete genome sequence) is also likely to contain
the enzyme, and you want to obtain a gene for the enzyme from your
crop species.
You could probe a Southern blot of genomic DNA from the plant
with a genomic or cDNA clone fromArabidopsisto confirm whether
there is a homologous gene. If you detect cross-hybridization, then
you could use theArabidopsissequence as a probe for a cDNA library
(and then a genomic library) from your crop species.
Alternatively, as you already have the sequence from at least two
other organisms (Arabidopsisand the source of the enzyme we started
with in (a)), you might be able to design (degenerate) PCR primers to
amplify a product directly from the crop’s genomic DNA (depending
on the presence of introns) or RNA (i.e. cDNA), which you then
sequence. Once you have obtained the right PCR product, you use it to
screen a cDNA library and then a genomic library. You might also be
able to get more sequence data by inverse PCR using the information
you got from sequencing your initial PCR product.
(f) You want to inactivate the gene in your plant of interest, to test for
its phenotype.
If you have a convenient transformation system, the most likely
ways to silence the gene are using antisense RNA, or RNAi. If you do
not have a convenient transformation system, then you might need
to use a model plant, such as Arabidopsis, and study the phenotype
there. For models like Arabidopsis, there are large collections of
mutants with different genes inactivated by transposon insertion,
and you may be able to obtain one of these for your gene of interest.
A mutant generated in this way is likely to have the gene fully
247 10.1 INTRODUCTION
inactivated, rather than just downregulated (which is what typically
happens with antisense and RNAi).
(g) You believe the enzyme interacts with other proteins, but do not
know which ones.
There are many conventional biochemical ways of approaching
this. You could simply look to see whether other proteins co-purify
with the protein of interest using a range of fractionation techniques.
If you have already made antibodies to your enzyme of interest, you
could try immunoprecipitation from extracts using the antibodies and
see whether

Kết quả (Việt) 1:

(iii) sử dụng phóng viên gen, hoặc như là một phản ứng tổng hợp tịnh giữa cácphóng viên và mã hóa trình tự cho men tiêu hóa hoặc như mộttranscriptional hợp giữa các phóng viên và promoter choenzym.(iv) sử dụng bioinformatic phân tích các chuỗi axít amin dự đoáncủa protein để xác định các giả định nhắm mục tiêu theo trình tự, và suy luậntừ nơi trong tế bào protein có vị trí.(d) Bioinformatic phân tích dự đoán rằng các protein nằm ở cáclục Lạp. Bạn muốn làm cho radioabelled protein để xemcho dù nó có thể được nhập khẩu vào lục Lạp bị cô lập.Bạn sao chép cDNA vào một vector cho phép sao chép trong ống nghiệmbằng cách sử dụng một RNA-polymerase phù hợp. Sau khi sao chép trong ống nghiệm, RNAđược dịch trong ống nghiệm sự hiện diện của một hoặc nhiều radioactivelydán nhãn axit amin, bằng cách sử dụng một hệ thống tổng hợp protein phù hợp, chẳng hạn nhưmột chiết xuất mầm lúa mì. Protein sau đó có thể được kiểm tra cho nhập khẩu vàolục Lạp. Lưu ý rằng nó sẽ là quan trọng để sử dụng một đầy đủ độ dài (hoặcgần đầy đủ) cDNA cho các thử nghiệm, vì vậy rằng bất cứ nhà ga Nnhắm mục tiêu thông tin trong các protein sẽ có khả năng được nguyên vẹn.(Hãy nhớ rằng bạn cũng có thể sử dụng một phản ứng tổng hợp tịnh tiến đến một phóng viêngen để kiểm tra vị trí của, như đã nêu trong (c) (iii) bên trên.)(e) bạn tranh luận rằng một cây cây trồng quan trọng bạn đang học tập (nhưng chocó là không có thứ tự hoàn thành genome) là cũng có khả năng chứamen tiêu hóa, và bạn muốn để có được một gen cho enzyme từ của bạncây trồng loài.Bạn có thể thăm dò một blot phía nam của gen DNA từ nhà máyvới một gen hoặc cDNA bản sao fromArabidopsisto xác nhận cho dùcó là một gen tương đồng. Nếu bạn phát hiện đường-lai ghép, sau đóbạn có thể sử dụng theArabidopsissequence như một thăm dò cho một thư viện cDNA(và sau đó là một thư viện gen) từ loài cây trồng.Ngoài ra, như bạn đã có thứ tự từ ít nhất haiCác sinh vật khác (Arabidopsisand là nguồn gốc của enzym chúng tôi bắt đầuvới tại (a)), bạn có thể thiết kế lớp lót Đảng Cộng sản Romania (thoái hóa) đểkhuyếch đại một sản phẩm trực tiếp từ các cây trồng gen DNA (tùy thuộctrên sự hiện diện của introns) hoặc RNA (tức là cDNA), mà bạn sau đótrình tự. Một khi bạn đã thu được các sản phẩm phải của Đảng Cộng sản Romania, bạn sử dụng nó đểmàn hình thư viện cDNA và sau đó là một thư viện gen. Bạn cũng có thểcó thể nhận được dữ liệu trình tự thêm bởi nghịch đảo PCR bằng cách sử dụng các thông tinbạn nhận từ xác định trình tự của bạn sản phẩm ban đầu của Đảng Cộng sản Romania.(f) bạn muốn hủy kích hoạt các gen trong nhà máy của bạn quan tâm, để kiểm trakiểu hình của nó.Nếu bạn có một hệ thống chuyển đổi tiện lợi, rất có thểcách để tắt các gen đang sử dụng antisense RNA, hoặc RNAi. Nếu bạn làmkhông có một hệ thống chuyển đổi thuận tiện, sau đó bạn có thể cầnđể sử dụng một mô hình thực vật, chẳng hạn như Arabidopsis, và nghiên cứu các kiểu hìnhcó. Đối với mô hình như Arabidopsis, có những bộ sưu tập lớn củađột biến với gen khác nhau gan bởi transposon chèn,và bạn có thể có được một trong những cho gen của bạn quan tâm.Một người đột biến tạo ra bằng cách này có thể có gen đầy đủ247 10,1 GIỚI THIỆUgan, chứ không phải là chỉ downregulated (đó là những gì thườngxảy ra với antisense và RNAi).(g) bạn tin rằng enzyme tương tác với các protein khác, nhưng khôngbiết mà những người.Có rất nhiều truyền thống sinh hóa cách tiếp cậnĐiều này. Bạn có thể chỉ cần nhìn thấy cho dù các protein khác đồng làm sạchvới lãi suất sử dụng một loạt các kỹ thuật phân protein.Nếu bạn đã thực hiện kháng thể để men tiêu hóa của bạn quan tâm, bạncó thể thử immunoprecipitation từ các chất chiết xuất bằng cách sử dụng các kháng thể vànhìn thấy cho dù

Kết quả (Việt) 2:

(Iii) các gen Sử dụng phóng viên, hoặc như là một sự hợp nhất tịnh giữa
phóng viên và các trình tự mã hóa cho các enzyme hoặc như một
sự hợp nhất giữa phiên mã các phóng viên và các promoter cho
các enzyme.
(iv) Sử dụng phân tích tin sinh học của các chuỗi axit amin dự đoán
của các protein để tìm ra trình tự nhắm mục tiêu giả định, và suy ra
từ những nơi trong tế bào protein nằm.
(d) phân tích tin sinh học dự đoán rằng các protein nằm trong
lục lạp. Bạn muốn làm cho protein radioabelled để xem
liệu nó có thể được nhập khẩu vào lục lạp bị cô lập.
Bạn clone cDNA vào một vector cho phép sao chép in vitro
sử dụng một RNA polymerase thích hợp. Sau khi phiên mã in vitro, các RNA
được phiên dịch trong ống nghiệm với sự hiện diện của một hoặc phóng xạ nhiều
nhãn axit amin, sử dụng một hệ thống tổng hợp protein thích hợp, chẳng hạn như
một tinh chất lúa mì mầm. Các protein sau đó có thể được kiểm tra nhập khẩu vào
lục lạp. Lưu ý rằng điều quan trọng là phải sử dụng một độ dài đầy đủ (hoặc
gần full-length) cDNA cho những thí nghiệm này, để bất kỳ N-terminal
thông tin nhắm mục tiêu vào các protein có khả năng là còn nguyên vẹn.
(Hãy nhớ rằng bạn cũng có thể sử dụng một fusion tịnh với một phóng viên
gene để kiểm tra vị trí dưới tế bào, như được nêu ở mục (c) (iii) ở trên.)
(e) Bạn cho rằng một cây trồng quan trọng bạn đang học (nhưng cho
đó có là không có trình tự bộ gen hoàn chỉnh) cũng có khả năng để chứa
các enzyme, và bạn muốn có được một gene cho enzyme từ bạn
loài cây trồng.
Bạn có thể thăm dò một Southern blot của gen DNA từ các nhà máy
với một bản sao fromArabidopsisto gen cDNA hoặc xác nhận cho dù
có là một gen tương đồng. Nếu bạn phát hiện cross-lai, sau đó
bạn có thể sử dụng như một máy dò theArabidopsissequence cho một thư viện cDNA
(và sau đó là một thư viện gen) từ các loài cây trồng của bạn.
Ngoài ra, khi bạn đã có các trình tự từ ít nhất hai
sinh vật khác (Arabidopsisand nguồn các enzyme, chúng tôi bắt đầu
với (a)), bạn có thể có thể để thiết kế (thoái hóa) mồi PCR để
khuếch đại một sản phẩm trực tiếp từ DNA của bộ gen của cây trồng (tùy thuộc
vào sự hiện diện của intron) hoặc RNA (tức là cDNA), từ đó bạn
trình tự. Một khi bạn đã thu được các sản phẩm PCR phải, bạn dùng nó để
lọc thư viện cDNA và sau đó là một thư viện bộ gen. Bạn cũng có thể có
thể để có được các dữ liệu chuỗi hơn bằng cách nghịch đảo PCR sử dụng các thông tin
bạn nhận được từ trình tự sản phẩm PCR ban đầu của bạn.
(f) Bạn muốn làm bất hoạt gen trong nhà máy của bạn quan tâm, để kiểm tra
kiểu hình của nó.
Nếu bạn có một Hệ thống chuyển đổi thuận tiện, rất có thể
những cách để bịt miệng các gen được sử dụng antisense RNA, hay RNAi. Nếu bạn
không có một hệ thống chuyển đổi thuận tiện, sau đó bạn có thể cần
phải sử dụng một cây mô hình, chẳng hạn như Arabidopsis, và nghiên cứu các kiểu hình
ở đó. Đối với các mô hình như Arabidopsis, có những bộ sưu tập lớn các
đột biến gen khác nhau bất hoạt bằng cách chèn transposon,
và bạn có thể có được một trong những gen cho bạn quan tâm.
Một đột biến được tạo ra theo cách này có thể có các gen hoàn toàn
247 10.1 GIỚI THIỆU
bất hoạt, thay vì chỉ downregulated (đó là những gì thường
xảy ra với antisense và RNAi).
(g) Bạn tin rằng các enzyme tương tác với các protein khác, nhưng không
biết những người thân.
Có nhiều cách thông thường sinh hóa tiếp cận
này. Bạn chỉ có thể nhìn xem liệu các protein khác đồng thanh lọc
với các protein quan tâm sử dụng một loạt các kỹ thuật phân đoạn.
Nếu bạn đã có kháng thể kháng enzyme của bạn quan tâm, bạn
có thể thử sử dụng chiết xuất từ immunoprecipitation các kháng thể và
xem liệu