Plumbagin (5-hydroxy, 2-methyl, 1-4

Plumbagin (5-hydroxy, 2-methyl, 1-4 naphthoquinone) is a potent natural naphthoquinone, possessing anti-cancer (Nair et al. 2008; Thasni et al. 2008), anti-malarial (Likhitwitayawuid et al. 1998), leishmanicidal (Chan-Bacab and Pena-Rodriguez 2001; Kayser et al. 2000), anti-microbial (Mossa et al. 2004; Wang and Huang 2005), anti-fertile (Bhargava 1984), anti-atherosclerosis (Ding et al. 2005), anti-mutagenic (Durga et al. 1992), and insecticidal (Kubo et al. 1983) activities. It is also reported to induce mammalian topoisomerase II-mediated DNA cleavage in vitro (Fujii et al. 1992). Plumbagin is shown to be a remedy for dyspepsia, piles, secondary syphilis, diarrhoea, and skin diseases. It stimulates the central nervous system (Kirtikar and Basu 1975) and is useful as a cardiotonic (Itoigawa et al. 1991). Plumbago spp. (P. indica, P. zeylanica, P. europea) roots serve as the most reliable natural sources of plumbagin. The mass harvest of the roots of these plants for plumbagin, slow growth of the plant and root accompanied with an increased demand necessitated the production of plumbagin through cell culture strategies. The production of plumbagin has been attempted through in vitro culture of P. zeylanica (Heble et al. 1974), Drosophyllum lusitanicum (Nahálka et al. 1996, 1998), Drosera natalensis and D. capensis (Crouch et al. 1990), D. gigantea (Budzianowski 2000), and Diospyros olen (Evans et al. 1999). Plumbagin production through suspension culture, immobilization, and elicitation has been reported in P. rosea (Komar aiah et al. 2001, 2002, 2003, 2004). The potential of hairy roots as a source of secondary metabolites has been recognized in several plants especially of that having root as the officinal part (Romero et al 2009; Rostampour et al. 2009; Ruiz-May et al. 2009; Shinde et al. 2009). In these plants, large-scale production of hairy roots helps to reduce the dependence on intact plants for the drug and also to cut off the mass destruction of natural resources. Assessment of plumbagin production through untransformed root culture has been demonstrated in P. rosea (Panichayupakaranant and Tewtrakul 2002). Induction of hairy roots and plumbagin yield has been assessed in P. zeylanica (Verma et al. 2002) and P. indica (Gangopadhyay et al. 2008). Expression of the GUS gene through Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation has also been demonstrated in P. zeylanica (Wei et al. 2006). Elicitation by abiotic agents is exemplified as one of the most efficient means to enhance economically valuable secondary metabolites in vitro (Ruiz-May et al. 2009; Shinde et al. 2009; Suthar and Ramawat 2010; Udomsuk et al. 2011). Transgenic plant regeneration through the mediation of hairy roots at low frequency has been accomplished in P. rosea (Satheeshkumar et al. 2009). Over-exploitation of natural resources, one of the major threats to biodiversity, demands the production of interested compounds through strategies like cell culture and hairy roots. The present studies on P. indica accomplish high-level production of plumbagin through elicitation of hairy roots and high frequency transgenic plant regeneration. Materials and Methods Hairy root induction Leaf and internode explants excised from in vitro-derived shoots (2-month-old) grown on MS (Murashige and Skoog 1962) medium with 8.8 mM N6 –benzyladenine (BA) and 2.5 mM indole-3-butyric acid (IBA) were used for the induction of hairy roots. Fresh cultures of Agrobacterium rhizogenes strain A4M70GUS (Sabovljevic et al. 2006) were used for the induction of hairy roots. A single colony of bacteria from solid Yeast Mannitol (YM) medium was transferred to 25 mL of YM liquid medium with 50 µg kanamycin mL–1, and the same was incubated at 28°C on a rotary shaker at 150 rpm for 24 h. The bacterial cultures were centrifuged at 6,000 rpm for 8 min and the pellet was dispersed in half-strength MS basal liquid medium with 200 µM acetosyringone (Sigma, USA). The bacterial suspension incubated for 2 - 3 h was used for co-cultivation. Co-cultivation Leaf (1 cm2 ) and internode (1 cm) explants derived from in vitro-grown shoot cultures were immersed in the bacterial suspension for 30 min with gentle shaking. The immersed explants were then blot dried using a sterile No. 1 Whatman filter paper, and transferred onto MS basal medium in a petridish and incubated 3 d in the dark. After a thorough wash in a sterile solution of cefotaxime (300 mg L–1) for 10 min, the co-cultivated explants were blot dried and cultured on MS basal medium containing 3% (w/v) sucrose and 300 mg L–1 cefotaxime. The explants cultured on MS basal medium without Agrobacterium infection were treated as controls. The developed roots (~100 mg) were subcultured either into liquid or on solid half-strength MS basal medium at 50-day intervals unless otherwise stated. The pH of all MS media was adjusted to 5.8, and the solid media were gelled with 0.8% (w/v) agar (Merck India, Ltd., Mumbai). All the cultures were incubated at 25 ± 2°C with 80 - 90% relative humidity. Liquid cultures were incubated on a rotary shaker at 80 rpm. The root cultures were incubated in the dark. In all cases, fresh weights of the roots produced in vitro were taken using an electronic balance (Mettler, Germany) after blot drying with Whatman No. 1 filter paper. Confirmation of A. rhizogenes-mediated transformation Histochemical assay of transformed roots Expression of GUS gene was assayed histochemically using X-gluc as per Jefferson et al. (1987). Roots developed from the co-cultivated and control (without co-cultivation) explants (also leaves of the transgenic plants) were incubated overnight in X-gluc solution at 37°C. The roots and leaves after treatment with X-gluc solution were incubated in 90% ethanol for the clear visualization of the characteristic blue staining of GUS gene expression. GUS gene staining of sample roots was also carried out at the end of each subculture in order to confirm the transformed nature. PCR analysis of transformed roots Transformation through A. rhizogenes A4M70GUS was confirmed by PCR analysis using the primers gus 392 (5’-CCCGGCAATAACATACGGCGTG- 3’) and gus 22 (5’-CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG-3’), and virD1 primers (5’-ATGTCGCAAGGACGTAAGCCCA-3’ and 5’-CGAGTCTTTCAGCATGGAGCAA-3’) purchased from Biogene, USA. The GUS gene amplifies a 366-bp fragment of the uidA coding region. The virD1 gene residing outside the TDNA of the Ri-plasmid, does not integrate into the plant genome. The virD1 primers, which amplify a 438-bp fragment, were used to rule out the chance of false GUS positive PCR by the presence of A. rhizogenes in hairy roots. Genomic DNA from hairy roots and control was extracted according to Dellaporta et al. (1983) with 3% (v/v) β-mercaptoethanol and 2% (w/v) polyvinylpyrrolidone. The purity of genomic DNA was examined by agarose (0.8%, w/v) gel electrophoresis, and the concentration of DNA was determined by UV-visible spectrophotometer (UV–1601, Shimadzu, Japan). PCR was performed in a volume of 25 mL using PCR buffer containing 1.5 mM MgCl2, 200 mM of each dNTPs, 200 pM each of gus 392 and gus 22 or of forward- and backward-virD1 primers, 100 ng genomic DNA, and 2 units of Taq polymerase (Biogene, USA). The plasmid DNA isolated from A. rhizogenes strain served as the positive control. A negative control was performed using all the components except the template DNA. DNA amplification was performed in a programmable MJ

Kết quả (Việt) 1:

Plumbagin (5-hydroxy, 2-methyl, 1-4 naphthoquinone) là một naphthoquinone tự nhiên mạnh, sở hữu chống ung thư (Nguyen et al. 2008; Thasni et al 2008), chống bệnh sốt rét (Likhitwitayawuid et al. năm 1998), leishmanicidal (Chan-Bacab và Pena-Rodriguez 2001; Kayser et al. 2000), chống vi khuẩn (Mossa et al. năm 2004; Wang và hoàng 2005), chống màu mỡ (Bhargava 1984), chống xơ vữa động mạch (Ding et al. 2005), chống mutagenic (Durga et al. 1992), và các hoạt động chống côn trùng (Kubo et al. 1983). Nó cũng được báo cáo để tạo ra các động vật có vú topoisomerase II trung gian DNA cát trong ống nghiệm (Fujii et al. 1992). Plumbagin chứng minh là một biện pháp khắc phục khó tiêu, cọc, Trung bệnh giang mai, tiêu chảy, và bệnh ngoài da. Nó kích thích hệ thần kinh trung ương (Kirtikar và Basu 1975) và là hữu ích như một cardiotonic (Itoigawa et al. năm 1991). Plumbago spp. (P. indica, P. zeylanica, P. europea) rễ phục vụ như là các nguồn tự nhiên đáng tin cậy nhất của plumbagin. Thu hoạch khối lượng của các gốc rễ của các loài cây này cho plumbagin, chậm phát triển của thực vật và gốc đi kèm với một nhu cầu tăng lên yêu cầu cần phải sản xuất plumbagin thông qua di động văn hóa chiến lược. Việc sản xuất của plumbagin đã cố gắng thông qua các văn hóa trong ống nghiệm của P. zeylanica (Heble et al. 1974), Drosophyllum lusitanicum (Nahálka et al. 1996, 1998), Drosera natalensis và D. capensis (Crouch et al. 1990), D. gigantea (Budzianowski năm 2000), và chi thị olen (Evans et al. năm 1999). Plumbagin sản xuất thông qua hệ thống treo văn hóa, cố định, và elicitation đã được báo cáo trong P. rosea (Komar aiah et al. năm 2001, 2002, 2003, 2004). Tiềm năng của lông rễ như là một nguồn chất chuyển hóa thứ cấp được công nhận trong một số loài đặc biệt là trong đó có gốc như là một phần officinal (Romero et al 2009; Rostampour et al. 2009; Ruiz-May et al. 2009; Shinde et al. năm 2009). Trong các nhà máy, quy mô lớn sản xuất của rễ lông giúp để giảm sự phụ thuộc vào các nhà máy còn nguyên vẹn cho thuốc và cũng có thể cắt hủy diệt hàng loạt tài nguyên thiên nhiên. Đánh giá của plumbagin sản xuất thông qua untransformed gốc văn hóa đã được chứng minh trong P. rosea (Panichayupakaranant và Tewtrakul năm 2002). Cảm ứng của lông rễ và plumbagin năng suất đã được đánh giá trong P. zeylanica (Verma et al. 2002) và P. indica (Gangopadhyay et al 2008). Biểu hiện của gen GUS thông qua Agrobacterium tumefaciens trung gian chuyển đổi cũng đã được chứng minh trong P. zeylanica (Ngụy et al. 2006). Elicitation của các đại lý abiotic exemplified là một trong những phương tiện hiệu quả nhất để nâng cao giá trị kinh tế Trung học chất chuyển hóa trong ống nghiệm (Ruiz-May et al. 2009; Shinde et al. 2009; Suthar và Ramawat 2010; Udomsuk et al. năm 2011). Biến đổi gen thực vật tái tạo thông qua hòa giải của rễ lông tại tần số thấp đã được hoàn thành trong P. rosea (Satheeshkumar et al 2009). Hơn, khai thác tài nguyên thiên nhiên, một trong những mối đe dọa lớn cho đa dạng sinh học, nhu cầu sản xuất các hợp chất quan tâm đến thông qua các chiến lược như di động văn hóa và lông rễ. Các nghiên cứu hiện nay trên P. indica thực hiện các sản xuất cao cấp của plumbagin qua elicitation của lông rễ và tần số cao thực vật biến đổi gen tái sinh. Vật liệu và phương pháp lông gốc cảm ứng lá và internode explants excised từ trong ống nghiệm-nguồn gốc cành (2-tháng tuổi) trồng trên MS (Murashige và Skoog 1962) trung bình với 8.8 mM N6-benzyladenine (BA) và 2.5 mM indol-3-butyric acid (IBA) đã được sử dụng cho cảm ứng của lông rễ. Nền văn hóa tươi của căng thẳng rhizogenes Agrobacterium A4M70GUS (Sabovljevic et al. 2006) đã được sử dụng cho cảm ứng của lông rễ. Một thuộc địa duy nhất của các vi khuẩn từ rắn nấm men Mannitol (YM) vừa được chuyển đến 25 mL YM lỏng trung bình với 50 μg kanamycin mL-1, và như vậy được ủ tại 28° C trên một shaker quay rpm 150 cho 24 h. Các nền văn hóa vi khuẩn đã ly tại 6.000 vòng/phút cho 8 phút và hạt được phân tán trong nửa-sức mạnh MS cơ sở môi lỏng với 200 μm acetosyringone (Sigma, Hoa Kỳ). Việc đình chỉ vi khuẩn ủ cho 2-3 h đã được sử dụng cho ngành chăn nuôi đồng. Trồng đồng lá (1 cm2) và internode (1 cm) explants bắt nguồn từ trong nền văn hóa phát triển ống nghiệm bắn đã được đắm mình trong việc đình chỉ do vi khuẩn trong 30 phút với lắc nhẹ nhàng. Explants đắm mình đã sau đó blot khô bằng cách sử dụng giấy lọc số 1 tráng nhựa Whatman vô trùng, và chuyển vào MS cơ sở trung bình trong một petridish, ủ 3 d trong bóng tối. Sau khi triệt để rửa vào dung dịch vô trùng cefotaxime (300 mg L-1) cho 10 phút, explants đồng trồng là blot khô và nuôi cấy trên MS cơ sở trung bình chứa 3% (w/v) Sucroza và 300 mg L-1 cefotaxime. Explants nuôi cấy trên MS phương tiện cơ sở mà không có Agrobacterium nhiễm đã được điều trị như điều khiển. Nguồn gốc phát triển (~ 100 mg) được subcultured thành chất lỏng hoặc trên một nửa sức mạnh rắn MS phương tiện cơ sở tại các khoảng 50 ngày trừ khi được nêu. Độ pH của MS tất cả phương tiện truyền thông được điều chỉnh để 5.8, và các phương tiện truyền thông rắn được gelled với 0,8% (w/v) agar (Merck Ấn Độ, Ltd, Mumbai). Tất cả các nền văn hóa đã được ủ tại 25 ± 2° C với 80-90% độ ẩm tương đối. Nền văn hóa lỏng được ủ trên một shaker quay ở 80 rpm. Các nền văn hóa gốc đã được ủ trong bóng tối. Trong mọi trường hợp, tươi trọng lượng của các gốc được sản xuất trong ống nghiệm được thực hiện bằng cách sử dụng một sự cân bằng điện tử (Mettler, Đức) sau khi blot làm khô bằng giấy tráng nhựa Whatman số 1 lọc. Xác nhận của A. trung gian rhizogenes chuyển đổi Histochemical khảo nghiệm của chuyển rễ biểu hiện của GUS gen assayed histochemically bằng cách sử dụng X-gluc theo Jefferson et al. (1987). Nguồn gốc phát triển từ đồng canh tác và kiểm soát (mà không có đồng canh tác) explants (cũng lá của cây trồng biến đổi gen) đã được ủ qua đêm trong X-gluc lúc 37 ° C. Rễ và lá sau khi điều trị với X-gluc giải pháp đã được ủ trong 90% ethanol cho hình dung rõ ràng của các đặc trưng màu xanh nhuộm của biểu hiện gen GUS. GUS gen nhuộm của mẫu gốc được cũng thực hiện vào cuối subculture mỗi để xác nhận sự chuyển. Đảng Cộng sản Romania phân tích của chuyển rễ chuyển đổi qua A. rhizogenes A4M70GUS đã được xác nhận bởi Đảng Cộng sản Romania phân tích bằng cách sử dụng các chất nền, mồi gus 392 (5'-CCCGGCAATAACATACGGCGTG-3') và gus 22 (5'-CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG-3'), và virD1 các lớp lót (5'-ATGTCGCAAGGACGTAAGCCCA-3' và 5'-CGAGTCTTTCAGCATGGAGCAA-3') mua từ Biogene, Hoa Kỳ. GUS gen khuếch đại một mảnh 366-bp của uidA mã vùng. VirD1 gen sinh sống bên ngoài TDNA Ri-plasmid không tích hợp vào bộ gen thực vật. Lớp lót virD1, khuyếch đại một đoạn 438-bp, đã được sử dụng để loại bỏ cơ hội của Đảng Cộng sản Romania tích cực GUS sai bởi sự hiện diện của A. rhizogenes lông gốc. Gen DNA từ lông rễ và kiểm soát được chiết xuất theo Dellaporta et al. (1983) với 3% (v/v) gọi là β-mercaptoethanol và 2% (w/v) polyvinylpyrrolidone. Độ tinh khiết của gen DNA được kiểm tra bởi agarose (cách 0.8%, w/v) gel điện, và nồng độ của DNA đã được xác định bởi có thể nhìn thấy UV phối (UV-1601, Shimadzu, Nhật bản). Đảng Cộng sản Romania được thực hiện trong một tập của 25 mL bằng cách sử dụng bộ đệm Đảng Cộng sản Romania có chứa 1,5 mM MgCl2, 200 mM mỗi dNTPs, 200 am mỗi gus 392 và gus 22 hoặc lớp lót phía trước - và lạc hậu-virD1, 100 của gen DNA và 2 đơn vị của Taq polymerase (Biogene, Hoa Kỳ). Plasmid ADN bị cô lập từ căng thẳng A. rhizogenes phục vụ như là điều khiển tích cực. Một kiểm soát tiêu cực được thực hiện bằng cách sử dụng tất cả các thành phần ngoại trừ các mẫu DNA. DNA khuếch đại được thực hiện vào một MJ lập trình

Kết quả (Việt) 2:

Plumbagin (5-hydroxy, 2-methyl, 1-4 naphthoquinone) là một naphthoquinone tự nhiên mạnh, sở hữu chống ung thư (Nair et al 2008;. Thasni et al 2008)., Chống sốt rét, (Likhitwitayawuid et al 1998). leishmanicidal (Chan-Bacab và Pena-Rodriguez năm 2001;. Kayser et al 2000), chống vi khuẩn (Mossa et al 2004;. Wang và Huang 2005), chống mỡ (Bhargava 1984), chống xơ vữa động mạch (Ding et al. 2005), chống gây đột biến (Durga et al. 1992), và côn trùng (Kubo et al. 1983) hoạt động. Nó cũng được báo cáo nhằm giới động vật có vú topoisomerase II qua trung gian phân cắt DNA trong ống nghiệm (Fujii et al. 1992). Plumbagin là thể hiện được một phương thuốc cho chứng khó tiêu, cọc, giang mai thứ cấp, tiêu chảy và các bệnh ngoài da. Nó kích thích hệ thần kinh trung ương (Kirtikar và Basu 1975) và là hữu ích như là một cardiotonic (Itoigawa et al. 1991). Than chì spp. (P. indica, P. zeylanica, P. europea) rễ phục vụ như là nguồn tự nhiên đáng tin cậy nhất của plumbagin. Vụ thu hoạch khối lượng của các gốc của các nhà máy này cho plumbagin, tăng trưởng chậm của các nhà máy và gốc đi kèm với nhu cầu tăng lên đòi hỏi phải sản xuất của plumbagin thông qua các chiến lược nuôi cấy tế bào. Việc sản xuất của plumbagin đã cố gắng thông qua nuôi cấy in vitro của P. zeylanica (Heble et al 1974)., Drosophyllum lusitanicum (Nahálka et al. 1996, 1998), Drosera natalensis và D. capensis (Crouch et al. 1990), D . gigantea (Budzianowski 2000), và Diospyros Olen (Evans et al. 1999). Plumbagin sản xuất thông qua văn hóa đình chỉ, cố định, và sự khám phá đã được báo cáo ở P. rosea (Komar aiah et al. 2001, 2002, 2003, 2004). Tiềm năng của rễ lông như là một nguồn của các chất chuyển hóa thứ cấp đã được ghi nhận trong một số nhà máy đặc biệt trong đó có gốc như là một phần dùng làm thuốc (Romero et al 2009; Rostampour et al 2009;. Ruiz-May et al 2009;. Shinde et al. 2009). Trong các nhà máy, sản xuất quy mô lớn của rễ lông giúp giảm thiểu sự phụ thuộc vào các nhà máy còn nguyên vẹn cho loại thuốc này và cũng để cắt đứt sự hủy diệt hàng loạt của các nguồn tài nguyên thiên nhiên. Đánh giá của plumbagin sản xuất thông qua văn hóa gốc chưa chuyển đổi đã được chứng minh ở P. rosea (Panichayupakaranant và Tewtrakul 2002). Cảm ứng của rễ lông và năng suất plumbagin đã được đánh giá trong P. zeylanica (Verma et al. 2002) và P. indica (Gangopadhyay et al. 2008). Chuyển đổi biểu hiện của gen GUS thông qua Agrobacterium tumefaciens qua trung gian cũng đã được chứng minh ở P. zeylanica (Wei et al. 2006). Khơi gợi bởi các đại lý vô sinh được minh chứng là một trong những phương tiện hiệu quả nhất để nâng cao chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị kinh tế trong ống nghiệm (Ruiz-May et al 2009;. Shinde et al 2009;. Suthar và Ramawat 2010; Udomsuk et al 2011.). Tái sinh cây chuyển gen thông qua sự trung gian của rễ lông ở tần số thấp đã được thực hiện trong P. rosea (Satheeshkumar et al. 2009). Khai thác quá mức các nguồn tài nguyên thiên nhiên, một trong những mối đe dọa lớn đối với đa dạng sinh học, nhu cầu sản xuất của các hợp chất quan tâm thông qua các chiến lược như nuôi cấy tế bào và rễ lông. Các nghiên cứu hiện nay trên P. indica hoàn thành sản xuất cao cấp của plumbagin qua sự khám phá của rễ lông và tần số cao tái sinh cây trồng biến đổi gen. Vật liệu và phương pháp cảm ứng gốc lông lá và cấy lóng cắt ra từ chồi in vitro có nguồn gốc từ (2 tháng tuổi) được trồng trên MS (Murashige và Skoog 1962) vừa với 8,8 mM N6 -benzyladenine (BA) và 2,5 mM indole-3- axit butyric (IBA) đã được sử dụng cho các cảm ứng của rễ lông. Nền văn hóa mới của Agrobacterium rhizogenes căng A4M70GUS (Sabovljevic et al. 2006) đã được sử dụng cho các cảm ứng của rễ lông. Một thuộc địa duy nhất của vi khuẩn từ men rắn Mannitol (YM) vừa được chuyển giao cho 25 ml YM môi trường lỏng với 50 mg kanamycin mL-1, và cùng được ủ ở 28 ° C, trong một shaker quay tại 150 rpm trong 24 h. Các nền văn hóa của vi khuẩn được ly tâm ở 6000 rpm trong 8 phút và thức ăn viên được phân tán trong nửa độ mạnh môi trường MS lỏng đáy với 200 mM acetosyringone (Sigma, USA). Việc đình chỉ do vi khuẩn ủ trong 2-3 h được dùng để hợp trồng trọt. Leaf Co-canh (1 cm2) và lóng (1 cm) cấy nguồn gốc từ nền văn hóa shoot in vitro trồng được đắm mình trong việc đình chỉ do vi khuẩn trong 30 phút với lắc nhẹ nhàng. Việc cấy chìm sau đó thấm khô bằng cách sử dụng một số từ 1 giấy lọc Whatman vô trùng, và được chuyển vào môi trường MS cơ bản trong một petridish và ủ 3 d trong bóng tối. Sau khi rửa kỹ lưỡng trong một dung dịch vô trùng của cefotaxime (300 mg L-1) trong 10 phút, các mẫu cấy đồng canh tác đã được thấm khô và nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản chứa 3% (w / v) sucrose và 300 mg L-1 cefotaxime. Việc cấy nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản không có nhiễm khuẩn Agrobacterium đã được điều trị như điều khiển. Rễ phát triển (~ 100 mg) đã được cấy vào một trong hai chất lỏng hoặc rắn nửa sức mạnh môi trường MS cơ bản trong khoảng thời gian 50 ngày trừ khi có quy định khác. Độ pH của tất cả các phương tiện truyền thông MS đã được điều chỉnh đến 5,8, và các phương tiện truyền thông vững chắc đã gel hóa với 0,8% (w / v) agar (Merck Ấn Độ, Ltd, Mumbai). Tất cả các nền văn hóa đã được ủ ở 25 ± 2 ° C với 80 - 90% độ ẩm tương đối. Nền văn hoá lỏng được ủ trên một shaker quay ở 80 rpm. Các nền văn hóa gốc được ủ trong bóng tối. Trong mọi trường hợp, trọng lượng tươi của các gốc sản xuất trong ống nghiệm đã được thực hiện bằng cách sử dụng một sự cân bằng điện tử (Mettler, Đức) sau khi sấy blot với Whatman số 1 tờ giấy lọc. Chứng nhận của A. rhizogenes qua trung gian chuyển đổi khảo nghiệm Histochemical của biến đổi rễ Biểu hiện của gen GUS được khảo nghiệm histochemically sử dụng X-gluc theo Jefferson et al. (1987). Rễ phát triển từ sự hợp trồng và kiểm soát (không có đồng trồng trọt) cấy (cũng lá của cây chuyển gen) được ủ qua đêm trong dung dịch X-gluc ở 37 ° C. Rễ và lá sau khi điều trị bằng dung dịch X-gluc được ủ trong 90% ethanol cho trực quan rõ ràng về nhuộm màu xanh đặc trưng của biểu hiện gen GUS. GUS nhuộm gen của rễ mẫu cũng đã được thực hiện vào cuối mỗi nét đẹp văn hóa để khẳng định bản chất biến đổi. Phân tích PCR của biến đổi rễ chuyển đổi qua A. rhizogenes A4M70GUS đã được khẳng định bằng phân tích PCR sử dụng cặp mồi gus 392 (5'-CCCGGCAATAACATACGGCGTG- 3 ') và gus 22 (5'-CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG-3'), và virD1 mồi (5'- ATGTCGCAAGGACGTAAGCCCA-3 'và 5'-CGAGTCTTTCAGCATGGAGCAA-3') mua từ Biogene, USA. Các gen GUS khuếch đại một đoạn 366 bp của vùng mã hóa uidA. Gen virD1 cư trú ngoài TDNA của Ri-plasmid, không tích hợp vào hệ gen thực vật. Các mồi virD1, mà khuếch đại một đoạn 438 bp, đã được sử dụng để loại trừ nguy cơ GUS sai PCR dương tính bởi sự hiện diện của A. rhizogenes trong rễ lông. DNA từ rễ lông và kiểm soát được chiết xuất theo Dellaporta et al. (1983), với 3% (v / v) β-mercaptoethanol và 2% (w / v) polyvinylpyrrolidone. Độ tinh khiết của DNA của bộ gen đã được kiểm tra bởi agarose (0,8%, w / v) gel electrophoresis, và nồng độ của DNA được xác định bằng tia cực tím có thể nhìn thấy quang phổ (UV-1601, Shimadzu, Nhật Bản). PCR được thực hiện trong một thể tích 25 ml sử dụng đệm PCR chứa 1,5 mM MgCl2, 200 mM của mỗi dNTP, mỗi gus 392 và gus 22 hoặc của tiến hơn và mồi ngược virD1 200 pm, 100 ng DNA của bộ gen, và 2 đơn vị của Taq polymerase (Biogene, USA). DNA plasmid được phân lập từ A. rhizogenes chủng phục vụ như kiểm soát tích cực. Một điều khiển âm được thực hiện bằng cách sử dụng tất cả các thành phần ngoại trừ các DNA template. Khuếch đại DNA đã được thực hiện trong một MJ lập trình