Gel Electrophoresis Separates DNA M

Gel Electrophoresis Separates DNA Molecules of Different Sizes
The same types of gel electrophoresis methods that have proved so useful in the analysis of proteins can determine the length and purity of DNA molecules. The procedure is actually simpler than for proteins: because each nucleotide in a nucleic acid molecule already carries a single negative charge (on the phosphate group), there is no need to add the negatively charged detergent SDS that is required to make protein molecules move uniformly toward the positive elec¬trode. For DNA fragments less than 500 nucleotides long, specially designed polyacrylamide gels allow the separation of molecules that differ in length by as little as a single nucleotide (Figure 8-33A). The pores in polyacrylamide gels, however, are too small to permit very large DNA molecules to pass; to separate these by size, the much more porous gels formed by dilute solutions of agarose (a polysaccharide isolated from seaweed) are used (Figure 8-33B). These DNA separation methods are widely used for both analytical and preparative purposes.
A variation of agarose-gel electrophoresis, called pulsed-field gel elec-trophoresis, makes it possible to separate even extremely long DNA molecules. Ordinary gel electrophoresis fails to separate such molecules because the steady electric field stretches them out so that they travel end-first through the gel in snakelike configurations at a rate that is independent of their length. In pulsed- field gel electrophoresis, by contrast, the direction of the electric field changes periodically, which forces the molecules to reorient before continuing to move snakelike through the gel. This reorientation takes much more time for larger molecules, so that longer molecules move more slowly than shorter ones. As a consequence, even entire bacterial or yeast chromosomes separate into discrete bands in pulsed-field gels and so can be sorted and identified on the basis of their size (Figure 8-33C). Although a typical mammalian chromosome of 108 base pairs is too large to be sorted even in this way, large segments of these chro¬mosomes are readily separated and identified if the chromosomal DNA is first cut with a restriction nuclease selected to recognize sequences that occur only rarely (once every 10,000 or more nucleotide pairs).
The DNA bands on agarose or polyacrylamide gels are invisible unless the DNA is labeled or stained in some way. One sensitive method of staining DNA is to expose it to the dye ethidium bromide, which fluoresces under ultraviolet light when it is bound to DNA (see Figure 8-33B.C). An even more sensitive detection method incorporates a radioisotope into the DNA molecules before elec¬trophoresis; 32p is often used as it can be incorporated into DNA phosphates and emits an energetic p particle that is easily detected by autoradiography, as in Fig¬ure 8-33. (For a discussion of radioisotopes, see p. 601).

Kết quả (Việt) 1:

Gel Electrophoresis tách phân tử ADN của các kích cỡ khác nhauCùng một loại gel electrophoresis các phương pháp đã chứng minh rất hữu ích trong phân tích protein có thể xác định chiều dài và độ tinh khiết của phân tử ADN. Thủ tục là thực sự đơn giản hơn cho protein: vì mỗi nucleotide trong phân tử axit nucleic đã mang điện tích âm đơn (trên nhóm phosphate), đó là không cần phải thêm chất tẩy rửa tiêu cực tính SDS là cần thiết để làm cho protein phân tử di chuyển theo hướng tích cực elec¬trode. Đối với những mảnh vỡ của ADN ít hơn 500 nucleotide dài, thiết kế đặc biệt polyacrylamide Gel cho phép tách các phân tử khác nhau ở độ dài của ít nhất là một nucleotide đơn (con số 8-33A). Các lỗ chân lông trong polyacrylamide gel, Tuy nhiên, là quá nhỏ để cho phép các phân tử ADN rất lớn để vượt qua; để tách các kích thước, gel xốp nhiều hơn được hình thành bởi các giải pháp loãng của agarose (một polysacarit bị cô lập từ rong biển) được sử dụng (con số 8-33B). Các phương pháp tách DNA được sử dụng rộng rãi cho mục đích phân tích và đáo.Một biến thể của agarose-gel electrophoresis, được gọi là lĩnh vực pulsed gel elec-trophoresis, làm cho nó có thể tách biệt các phân tử ADN thậm chí rất dài. Bình thường gel electrophoresis không tách các phân tử như vậy vì ổn định điện trường trải dài chúng vì vậy mà họ đi du lịch cuối-lần đầu tiên thông qua các gel trong các cấu hình snakelike tại một tỷ lệ đó là độc lập với chiều dài của họ. Trong lĩnh vực pulsed gel electrophoresis, ngược lại, sự chỉ đạo của điện trường thay đổi theo định kỳ, lực lượng các phân tử để reorient trước khi tiếp tục để di chuyển snakelike thông qua các gel. Reorientation này mất nhiều thời gian cho các phân tử lớn hơn, do đó lâu hơn các phân tử di chuyển chậm hơn so với ngắn hơn. Như một hệ quả, thậm chí toàn bộ các vi khuẩn hoặc nấm men nhiễm sắc thể tách thành các ban nhạc rời rạc trong lĩnh vực pulsed gel và vì vậy có thể được sắp xếp và xác định trên cơ sở các kích thước của họ (con số 8-33 C). Mặc dù một nhiễm sắc thể đặc trưng của động vật có vú của 108 cặp cơ sở là quá lớn để được sắp xếp ngay cả trong cách này, các phân đoạn lớn của các chro¬mosomes dễ dàng tách ra và được xác định nếu nhiễm sắc thể ADN đầu tiên cắt với một nuclease hạn chế lựa chọn để nhận ra trình tự chỉ hiếm khi xảy ra (một lần mỗi 10.000 hoặc hơn nucleotide cặp).Ban nhạc DNA agarose hay polyacrylamide gel là vô hình, trừ khi các DNA có nhãn hoặc nhuộm màu trong một số cách. Một trong những phương pháp nhạy cảm nhuộm DNA là tiếp xúc với thuốc nhuộm ethidium bromua, fluoresces dưới tia cực tím ánh sáng khi nó là ràng buộc để ADN (xem hình 8-33B. C). một phương pháp phát hiện nhạy cảm nhiều hơn kết hợp một đồng vị phóng xạ vào các phân tử ADN trước khi elec¬trophoresis; 32p thường được dùng vì nó có thể được tích hợp vào ADN phốt phát và phát ra một hạt năng lượng p một cách dễ dàng được phát hiện bởi autoradiography, như trong Fig¬ure 8-33. (Cho một cuộc thảo luận của các đồng vị phóng xạ, xem p. 601).

Kết quả (Việt) 2:

Gel điện di DNA tách phân tử của kích cỡ khác nhau
của cùng một loại phương pháp điện di gel đã chứng minh rất hữu ích trong việc phân tích các protein có thể xác định độ dài và độ tinh khiết của các phân tử DNA. Các thủ thuật này thực sự đơn giản hơn so với protein: vì mỗi nucleotide trong một phân tử axit nucleic đã mang một điện tích âm duy nhất (trên nhóm phosphate), không có cần phải thêm SDS chất tẩy rửa tích điện âm là cần thiết để làm cho các phân tử protein chuyển thống nhất về phía elec¬trode tích cực. Đối với DNA mảnh vỡ nhỏ hơn 500 nucleotide dài, gel polyacrylamide thiết kế đặc biệt cho phép phân tách các phân tử khác nhau về chiều dài của ít nhất là một nucleotide đơn (Hình 8-33A). Các lỗ chân lông trên gel polyacrylamide, tuy nhiên, quá nhỏ để cho phép các phân tử DNA rất lớn để vượt qua; để tách chúng bằng cách kích thước, xốp hơn nhiều gel được hình thành bởi các giải pháp dịch loãng của agarose (một polysaccharide phân lập từ rong biển) được sử dụng (hình 8-33B). Những phương pháp tách DNA được sử dụng rộng rãi cho cả mục đích phân tích và dự bị.
Một biến thể của agarose gel điện di, được gọi là xung-field gel elec-trophoresis, làm cho nó có thể tách phân tử DNA thậm chí cực kỳ dài. Ordinary gel điện di không tách riêng phân tử như vậy bởi vì điện trường ổn định kéo dài chúng ra để họ đi du lịch cuối đầu tiên thông qua gel trong cấu hình rồng rắn ở một tỷ lệ đó là độc lập với chiều dài. Trong pulsed- điện trường gel, ngược lại, theo hướng của điện trường thay đổi định kỳ, trong đó lực lượng các phân tử để định hướng lại trước khi tiếp tục di chuyển rồng rắn qua gel. Định hướng này mất nhiều thời gian hơn cho các phân tử lớn hơn, do đó các phân tử còn di chuyển chậm hơn so với những người thân ngắn hơn. Như một hệ quả, thậm chí toàn bộ nhiễm sắc thể của vi khuẩn hoặc nấm men phân chia thành các ban nhạc rời rạc trong gel xung trường và do đó có thể được phân loại và xác định trên cơ sở kích thước của chúng (Hình 8-33C). Mặc dù một nhiễm sắc thể động vật có vú điển hình của 108 cặp base là quá lớn để được sắp xếp ngay cả trong cách này, bộ phận lớn những chro¬mosomes được dễ dàng tách ra và xác định nếu các DNA nhiễm sắc thể là lần đầu tiên cắt bằng một nuclease hạn chế lựa chọn để nhận ra các chuỗi mà chỉ xảy ra hiếm khi (một lần hoặc nhiều hơn 10.000 cặp nucleotide).
các băng DNA trên agarose hoặc polyacrylamide gel là vô hình trừ khi DNA được dán nhãn hoặc nhuộm màu một cách nào đó. Một phương pháp nhạy cảm của DNA nhuộm là để tiếp xúc với thuốc nhuộm ethidium bromide, mà phát huỳnh quang dưới ánh sáng cực tím khi nó được gắn vào DNA (xem Hình 8-33B.C). Một phương pháp phát hiện thậm chí còn nhạy cảm hơn kết hợp một đồng vị phóng xạ vào các phân tử DNA trước khi elec¬trophoresis; 32P thường được sử dụng vì nó có thể được tích hợp vào DNA phốt phát và phát ra một hạt p tràn đầy năng lượng và dễ dàng được phát hiện bởi autoradiography, như trong Fig¬ure 8-33. (Đối với một cuộc thảo luận của các đồng vị phóng xạ, xem tr. 601).