Insight into the mode of DNA replic

Insight into the mode of DNA replication: the Meselson–Stahl experiment
The mode of replication was determined in 1958 by Matthew Meselson and Franklin W. Stahl. They
designed an experiment to distinguish between semiconservative, conservative, and dispersive replication.
First, they needed a way to tell original DNA from newly synthesized DNA. To this end, they grew
Escherichia coliin medium containing
15
N, a heavy isotope of nitrogen. 15
N contains one more neutron than
the naturally occurring
14
N. Unlike radioisotopes, 15
N is stable and is not radioactive. After growing several
generations of bacteria in the
15
N medium, the DNA of E. colibecame denser because the nitrogenous bases
had incorporated the heavy isotope.
The density of the strands was determined using a technique known as density-gradient centrifugation.
A solution of cesium chloride (CsCl) – a heavy metal salt – containing the DNA samples is spun in an
ultracentrifuge at high speed for several hours. Eventually, an equilibrium between centrifugal force and
diffusion occurs, such that a gradient forms with a high concentration of CsCl at the bottom of the tube
and a low concentration at the top. DNA forms a band in the tube at the point where its density is the same
as that of the CsCl. The bands are detected by observing the tubes with ultraviolet light at a wavelength of
260 nm, in which DNA absorbs strongly.
After many generations, Meselson and Stahl transferred the bacteria with heavy (
15N) DNA to a medium
containing only
14
N. What they found was that DNA replicated in the 14
N medium was intermediate in
density between light (
14
N) and heavy (15
N). In the next generation, only DNA of intermediate and light
density was present. The results shown in Fig. 6.2 are consistent only with semiconservative replication. If
replication had been conservative, there would have been two bands at the first generation of replication
– an original
15
N (heavy) double helix and a new 14
N (light) double helix. Additionally, throughout the
experiment, the original DNA would have continued to show up as a
15
N (heavy) band. If the method of
replication had been dispersive, the result would have been various multiple-banded patterns, depending on
the degree of dispersiveness.
Insight into the mode of DNA replication: visualization of replicating bacterial DNA
The semiconservative method of replication was visually verified by J. Cairns in 1963 using the technique
of autoradiography. This technique makes use of the fact that radioactive emissions expose photographic
film. The visible silver grains on the film can then be counted to provide an estimate of the quantity of
radioactive material present. Cairns grew E. coliin a medium containing the base thymine labeled with
tritium, a radioactive isotope of hydrogen (
3
H). The DNA was then extracted from the bacteria and
autoradiographs were made. By analysis of DNA at different time points during replication (it takes
approximately 42 minutes to replicate the entire genome), Cairns showed that replication of the circular
Figure 6.2 (opposite) The Meselson and Stahl experiment to determine the mode of DNA
replication.Meselson and Stahl shifted 15
N-labeled E. coli cells to a
14
N medium for several generations, and then
subjected the bacterial DNA to CsCl gradient ultracentrifugation. The bands after centrifugation come about from
semiconservative replication of
15
N DNA (blue) replicating in a 14
N medium (green). (Inset) (A) Photographs of the
centrifuge tubes under ultraviolet illumination. The dark bands correspond to heavy
15
N-labeled DNA (right) and light
14
N-labeled DNA (left). A band of intermediate density was also observed between these two and is the predominant
band observed at 1.0 and 1.1 generations. This band corresponds to double-stranded DNA molecules in which one
strand is labeled with
15
N, and the other with 14
N. After 1.9 generations, there were approximately equal quantities of
the
15
N/14
N band and the 14
N band. After three or four generations, there was a progressive depletion of the 15
N/14N
band and a corresponding increase in the
14
N band, as expected for semiconservative replication. (B) Densitometer
tracings of the bands in panel (A), which can be used to quantify the amount of DNA in each band. (Reprinted by
permission of Matthew Meselson from: Meselson, M., Stahl, F. 1958. The replication of DNA in Escherichia coli.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA44:671–682.)
Chapter 6 112
genome was bidirectional. The two strands in the double helix separate at an origin of replication, exposing
bases to form a cytologically visible replication “eye” or “bubble” that contains two replication forks. The
two replication forks proceed in opposite directions around the circle (Fig. 6.3). During replication, the
chromosome looks like the Greek letter theta (θ) by electron microscopy. Replication intermediates are thus
termed “theta structures.” Cairns’ findings have subsequently been verified by both autoradiographic and
genetic analysis.
6.3DNA synthesis occurs from 5′ to 3′
Before exploring the complexity of eukaryotic DNA replication, some basic principles common to most
DNA replication pathways will be described. We now know that during semiconservative replication, the
new strand of DNA is synthesized from 5′ to 3′. Nucleotides are added one at a time to the 3′ hydroxyl
end of the DNA chain, forming new phosphodiester bonds. Deoxynucleoside 5′ triphosphates (dNTPs) are
the building blocks. The terminal two phosphates are lost in the reaction, making the reaction essentially
irreversible (Fig. 6.4). The choice of nucleotide to add to the chain is determined by complementary base
pairing with the template strand. Details of the exact mechanism for how this process occurs varies for cells,
organelle genomes, plasmids, and viruses. The mode of replication depends, in part, on whether the genome
is circular or linear. The most common mode of replication is semidiscontinuous DNA replication. Other
mechanisms include continuous DNA replication and rolling circle replication.
6.4DNA polymerases are the enzymes that catalyze DNA
synthesis
Enzymes that polymerize nucleotides into a growing strand of DNA are called DNA polymerases. Over the
past few years, the number of known DNA polymerases in both prokaryotes and eukaryotes has grown
tremendously. Bacteria have five different DNA polymerases (Focus box 6.1), whereas mammalian cells are
now known to contain at least 14 distinct DNA polymerases (Table 6.1). In eukaryotes, three different DNA
polymerases are involved in chromosomal DNA replication: DNA polymerase α, DNA polymerase δ, and
DNA polymerase ε. DNA polymerase γis used strictly for mitochondrial DNA (mtDNA) replication. These
four enzymes are referred to as the replicative polymerases, to distinguish them from the remaining polymerases
that are involved in repair processes. The repair polymerases will be discussed in detail in Chapter 7.
All the known DNA polymerases can only add nucleotides in the 5′→3′ direction. In other words, a
DNA polymerase can catalyze the formation of a phosphodiester bond between the first 5′-phosphate group
of a new dNTP and the 3′-hydroxyl group of the last nucleotide in the newly synthesized strand (Fig. 6.4).
But the DNA polymerases cannot act in the opposite orientation to create a phosphodiester bond with the
5′-phosphate of a nucleotide already in the DNA and the 3′-hydroxyl of a new dNTP.
Another feature of DNA polymerases is that they cannot initiate DNA synthesis de novo(Latin for “from
the beginning”). With the exception of DNA polymerase α(the polymerase involved in primer synthesis),
they all require a “primer.” The primer is usually a short RNA chain which must be synthesized on the
DNA template before DNA polymerase can start elongation of a new DNA chain (primers are discussed in
detail below). DNA polymerases recognize and bind to the free 3′-hydroxyl group at the end of the primer.
Once primed, polymerases can extend pre-existing chains rapidly and with high fidelity. Bacterial and
mammalian DNA polymerases can add ~500 and ~50 nt/second, respectively.
6.5Semidiscontinuous DNA replication
The major form of replication that occurs in nuclear DNA (eukaryotes), some viruses (e.g. the papovavirus
SV40), and bacteria is called semidiscontinuous DNA replication. Fundamental features are conserved from
E. colito humans. The differences are in the details; that is, in the specific enzymes and other proteins that
are involved in the process (Table 6.2).

Kết quả (Việt) 1:

Cái nhìn sâu sắc vào chế độ sao chép DNA: thử nghiệm Meselson-StahlChế độ bản sao đã được xác định năm 1958 bởi Matthew Meselson và Franklin W. Stahl. Họthiết kế một thử nghiệm để phân biệt giữa semiconservative, bảo thủ và hòa tan trong nhân rộng.Trước tiên, họ cần một cách để cho biết bản gốc DNA từ mới được tổng hợp DNA. Để kết thúc này, họ đã tăng trưởngEscherichia coliin trung bình chứa 15N, một đồng vị nặng của nitơ. 15N có một neutron thêm hơnxuất hiện tự nhiên 14N. không giống như các đồng vị phóng xạ, 15N là ổn định và không phải là phóng xạ. Sau khi phát triển một sốcác thế hệ của các vi khuẩn trong các 15N vừa, DNA E. colibecame dày đặc hơn vì các căn cứ nitrogenousđã kết hợp đồng vị nặng.Mật độ của các sợi đã được xác định bằng cách sử dụng một kỹ thuật được gọi là mật độ gradient số. Một giải pháp của cesium clorua (CsCl)-một muối kim loại nặng-có các mẫu DNA spun trong mộtultracentrifuge ở tốc độ cao trong nhiều giờ. Cuối cùng, một trạng thái cân bằng giữa lực ly tâm vàkhuếch tán xảy ra, như vậy mà một gradient tạo thành với nồng độ cao của CsCl ở phía dưới của ống và một nồng độ thấp ở phía trên. DNA tạo thành một ban nhạc trong ống tại điểm nơi mật độ của nó là như vậynhư là của CsCl. Các ban nhạc được phát hiện bằng cách quan sát các ống với tia cực tím ánh sáng tại bước sóng của260 nm, trong đó DNA hấp thụ mạnh mẽ.Sau nhiều thế hệ, Meselson và Stahl chuyển vi khuẩn với nặng)15N) DNA để một phương tiệncó chỉ 14N. những gì họ thấy là rằng DNA nhân rộng trong 14N vừa là trung gian trongmật độ giữa ánh sáng)14N) và nặng (15N). trong thế hệ tiếp theo, chỉ có DNA của trung bình và ánh sángmật độ là hiện tại. Các kết quả hiển thị trong hình 6.2 là phù hợp chỉ với semiconservative nhân rộng. Nếusao chép được bảo thủ, nào đã có hai ban nhạc lúc thế hệ đầu tiên của sao chép -một bản gốc 15Xoắn kép N (nặng) và một mới 14Xoắn kép N (ánh sáng). Ngoài ra, trong suốt cácthử nghiệm, DNA ban đầu đã có tiếp tục xuất hiện như là một 15Ban nhạc N (nặng). Nếu phương phápsao chép đã tán sắc, kết quả sẽ có là dải nhiều mô hình khác nhau, tùy thuộc vàomức độ dispersiveness.Cái nhìn sâu sắc vào chế độ sao chép DNA: hình dung của sao chép DNA do vi khuẩnPhương pháp semiconservative sao chép trực quan đã được xác minh bởi J. Cairns 1963 việc sử dụng các kỹ thuật của autoradiography. Kỹ thuật này làm cho việc sử dụng một thực tế rằng phóng xạ phát thải lộ hình ảnhbộ phim. Các hạt bạc có thể nhìn thấy bộ phim sau đó có thể được tính để cung cấp một ước tính số lượng củachất phóng xạ hiện nay. Cairns lớn E. coliin, một phương tiện có chứa thymine cơ sở nhãntriti, một đồng vị phóng xạ của hiđrô)3H). The DNA sau đó được chiết xuất từ các vi khuẩn vàautoradiographs đã được thực hiện. Bằng cách phân tích DNA tại thời gian khác nhau điểm trong nhân rộng (phải mấtkhoảng 42 phút để nhân rộng toàn bộ bộ gen), Cairns cho thấy rằng bản sao của vòng trònCon số 6.2 (đối diện) The Meselson và Stahl thử nghiệm để xác định các chế độ của DNAsao chép. Meselson và Stahl chuyển 15N có nhãn E. coli tế bào để một 14N phương tiện cho nhiều thế hệ, và sau đóchịu DNA vi khuẩn CsCl gradient ultracentrifugation. Các ban nhạc sau khi số trở về từsemiconservative bản sao của 15N DNA (màu xanh) sao chép trong một 14N các trung bình (màu xanh lá cây). (Ghép) (A) hình ảnh của cácMáy ly tâm ống dưới tia cực tím chiếu sáng. Các ban nhạc tối tương ứng với nặng 15N có nhãn DNA (bên phải) và ánh sáng14N có nhãn DNA (bên trái). Một nhóm người dân với mật độ trung gian cũng quan sát thấy giữa hai và là những chủ yếuBan nhạc quan sát tại 1.0 and 1.1 thế hệ. Ban nhạc này tương ứng với phân tử DNA đôi-stranded trong đó mộtStrand được dán nhãn với 15N, và khác với 14N. sau khi cách 1.9 thế hệ, đã có khoảng tương đương với số lượng củaCác 15N/14Ban nhạc N và 14Ban nhạc N. Sau ba hoặc bốn thế hệ, đã có một sự suy giảm tiến bộ của 15N/14NBan nhạc và tương ứng một tăng trong các 14N ban nhạc, như mong đợi để nhân rộng semiconservative. (B) densitometertracings của ban nhạc trong bảng điều khiển (A), mà có thể được sử dụng để định lượng số DNA trong mỗi ban nhạc. (Tái bản bởisự cho phép của Matthew Meselson từ: Meselson, M., Stahl, F. năm 1958. Các bản sao của DNA trong Escherichia coli.Thủ tục tố tụng của Viện Hàn lâm khoa học quốc gia USA44:671-682.)Chương 6 112gen là hai chiều. Hai sợi trong xoắn kép riêng biệt tại một nguồn gốc của nhân rộng, để lộcăn cứ để tạo thành một cytologically có thể nhìn thấy nhân rộng "mắt" hay "bong bóng" có chứa hai bản sao forks. Cáchai bản sao nhánh tiến hành ở hướng đối diện xung quanh vòng tròn (hình 6.3). Trong bản sao, cácnhiễm sắc thể trông giống như chữ cái Hy Lạp theta (i) bằng kính hiển vi điện tử. Sao chép trung gian như vậygọi là "cấu trúc theta." Cairns' phát hiện sau đó đã được xác minh bởi cả hai autoradiographic vàphân tích di truyền.6.3DNA tổng hợp diễn ra từ 5 ' 3 'Trước khi khám phá sự phức tạp của sinh vật nhân chuẩn DNA nhân rộng, một số nguyên tắc cơ bản chung cho hầu hếtDNA nhân rộng con đường sẽ được mô tả. Bây giờ chúng ta biết rằng trong bản sao semiconservative, cácmới các sợi DNA được tổng hợp từ 5 ' để 3 '. Nucleotide được thêm vào một lúc một thời gian để hiđrôxyl 3 ' kết thúc của chuỗi ADN, tạo mới phosphodiester trái phiếu. Deoxynucleoside 5 ' triphosphates (dNTPs)các khối xây dựng. Phốt phát hai thiết bị đầu cuối bị mất trong phản ứng, làm cho phản ứng về cơ bảnkhông thể đảo ngược (hình 6.4). Sự lựa chọn của nucleotide để thêm vào chuỗi được xác định bởi cơ sở bổ sungghép nối với mẫu strand. Các chi tiết của cơ chế chính xác cho tiến trình này xảy ra như thế nào khác nhau cho các tế bào,organelle bộ gen, plasmid, và vi rút. Chế độ bản sao phụ thuộc, một phần, về việc có bộ genlà hình tròn hoặc tuyến tính. Chế độ phổ biến nhất của sao chép là semidiscontinuous DNA nhân rộng. Kháccơ chế bao gồm liên tục DNA nhân rộng và cán vòng tròn bản sao.6.4DNA polymerase là các enzyme xúc tác DNATổng hợpEnzym polymerize nucleotide vào một sợi DNA ngày càng tăng danh xưng trong tiếng Pháp là DNA polymerase. Qua cáctrong quá khứ vài năm, số lượng được biết đến DNA polymerase trong cả hai sơ và sinh vật nhân chuẩn đã phát triểnrất nhiều. Vi khuẩn có năm khác nhau DNA polymerase (tập trung hộp 6.1), trong khi các tế bào động vật có vúbây giờ biết là có chứa ít 14 khác biệt DNA polymerase (bảng 6.1). Trong sinh vật nhân chuẩn, ba DNA khác nhaupolymerase có liên quan trong nhiễm sắc thể DNA nhân rộng: DNA polymerase α, DNA polymerase δ, vàDNA polymerase ε. DNA polymerase γis sử dụng nghiêm chỉnh cho mitochondrial DNA (mtDNA) sao chép. Đây bốn enzyme được gọi là replicative polymerase, để phân biệt chúng từ polymerase còn lạiđó tham gia vào quá trình sửa chữa. Sửa chữa polymerase sẽ được thảo luận chi tiết trong chương 7.Tất cả các ADN polymerase nổi tiếng chỉ có thể thêm nucleotide theo hướng 5′→3′. Nói cách khác, mộtDNA polymerase có thể xúc tác sự hình thành của một trái phiếu phosphodiester giữa 5 '-phosphate nhóm đầu tiênmột dNTP mới và nhóm chức hiđrôxyl 3 ' cuối nucleotide trong sợi tổng hợp mới (hình 6.4).Nhưng các ADN polymerase không thể hành động theo định hướng đối diện để tạo ra một trái phiếu phosphodiester với các5 '-phosphate của một nucleotide đã có trong DNA và hiđrôxyl 3 ' một dNTP mới.Một tính năng của DNA polymerase là rằng họ không thể bắt đầu DNA tổng hợp de novo (tiếng Latin cho "từThe beginning"). Ngoại trừ DNA polymerase α (polymerase tham gia vào mồi tổng hợp),họ tất cả yêu cầu một mồi"." Mồi thường là một chuỗi RNA ngắn mà phải được tổng hợp vào cácDNA mẫu trước khi DNA polymerase có thể bắt đầu kéo dài một chuỗi DNA mới (chất nền, mồi được thảo luận trongchi tiết dưới đây). DNA polymerase công nhận và liên kết với các nhóm chức hiđrôxyl 3 ' miễn phí vào mồi.Một khi sơn lót, polymerase có thể mở rộng dây chuyền sẵn nhanh chóng và với độ trung thực cao. Vi khuẩn vàđộng vật có vú DNA polymerase có thể thêm ~ 500 và ~ 50 nt/thứ hai, tương ứng.6.5Semidiscontinuous sao chép DNACác hình thức chính của nhân bản xảy ra trong ADN (sinh vật nhân chuẩn), một số virus (ví dụ như papovavirusSV40), và vi khuẩn được gọi là semidiscontinuous DNA nhân rộng. Tính năng cơ bản được bảo tồn từE. colito con người. Sự khác biệt là trong các chi tiết; có nghĩa là, trong các enzym cụ thể và các protein khác màđang tham gia vào quá trình (bảng 6.2).