Chemicals and Drugs.The raw extract

Chemicals and Drugs.
The raw extract of Scutellaria baicalensis was prepared by boiling dried root of the plant in water, followed by a spray-drying process of the water extract. The powder form of the extract was supplied by Q-Herb Laboratory (New York, NY) and was dissolved in medium to 20 mg/ml, vortexed at room temperature for 1 min, and incubated at 37°C for 1 h while rotating before use. This solution was centrifuged at 5000 rpm for 10 min to remove any insoluble ingredients. The supernatant was passed through a 0.22-μm filter for sterilization and diluted with culture medium to final concentrations of 1.5–1500 μg/ml Scutellaria baicalensis extract. Fifty mM stock solutions of baicalein (Sigma, St. Louis, MO) and indomethacin (Sigma) and 10 mM stock solution of celecoxib [SC-58635; 4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1]-benzene-sulfonamide; Searle Research and Development, St. Louis, MO] were prepared with DMSO (Sigma) and diluted with culture medium to final concentrations of 5–400 μM. Control cells received DMSO (0.25%) or culture medium only.

Cell Lines and Tissue Culture.
Two human squamous cell carcinoma cell lines (KB and SCC-25) were purchased from American Type Culture Collection (Manassas, VA). The rationale of using two cell lines is that squamous cell carcinoma is a heterogeneous cancer and there may be a difference in their response to drugs. SCC-25 cell line was derived from tongue squamous cell carcinoma and was grown in a 50:50 mixture of DMEM (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) and F12 (Life Technologies, Inc.) containing 10% FBS (Life Technologies, Inc.) and 1% Antibiotic-Antimycotic (Life Technologies, Inc.). KB cell line was derived from an oral floor squamous cell carcinoma containing human papilloma virus 18 sequences and was cultured in DMEM containing 10% FBS and 1% Antibiotic-Antimycotic mixture. In addition, a nontumorigenic human oral squamous cell line, HaCaT, was used as a control for growth inhibition study (19 , 20) . HaCaT cell line was kindly obtained from Dr. Jonathon Garlick (State University of New York at Stony Brook, Stony Brook, NY) and cultured in MEM containing 10% FBS and 1% Antibiotic-Antimycotic mixture. Cell lines were maintained at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO2.

Cell Viability Assay.
The percentage of growth inhibition was determined by using a MTT (Sigma) assay to measure viable cells. A total of 2.5 × 10 3 cells/well was seeded onto a 96-well plate for 24 h, treated with various concentrations of Scutellaria baicalensis, baicalein, indomethacin, and celecoxib, and incubated for an additional 3 days at 37°C. Subsequently, 10 μl of MTT at a concentration of 5 mg/ml was added to each well, and cells were incubated for an additional 4–6 h. The supernatant was aspirated, and 100 μl of DMSO were added to the wells to dissolve any precipitate present. The absorbance was then measured at a wavelength of 570 nm using an ELX800 reader (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT).

Cell Cycle Analysis.
A total of 1.5 × 105 cells/well was plated onto 6-well plates and incubated for 24 h at 37°C. Various concentrations of Scutellaria baicalensis, baicalein, indomethacin, and celecoxib were added to the wells and incubated for an additional 3 days. Cells were then washed, pelleted, fixed with cold 70% ethanol for at least 30 min, and incubated with 100 μg/ml RNase A and 50 μg/ml propidium iodide in PBS at room temperature for 30 min. Samples were immediately analyzed by flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA). Cell cycle phase distribution was determined using Modfit software (Verity Software House, Topsham, ME).

Immunohistochemical Analysis of PCNA Expression.
Harvested cells were applied to polylysine-coated slides by centrifugation at 800 rpm for 5 min in a Cytospin instrument (Sakura Finetek USA, Torrance, CA). Cells were air dried and fixed in 100% acetone for 10 min at 4°C. Slides were then incubated with 3% hydrogen peroxide to quench endogenous peroxidase activity for 5 min. After three washings with PBS, slides were incubated with serum blocking solution for 20 min at room temperature. The solution was blotted, and 2 μg/ml primary mouse monoclonal anti-PCNA antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) were added. Cells were then incubated at 4°C overnight. After three washings with PBS, the slides were incubated for 10 min with biotinylated goat antimouse antibodies at room temperature (Zymed Laboratory, San Francisco, CA). Slides were washed three more times with PBS and then incubated for 10 min with streptavidin-peroxidase conjugate at room temperature (Zymed Laboratory). Color was developed by the addition of diaminobenzoate chromogen (Zymed Laboratory), and slides were counterstained with hematoxylin. Cells with brown nuclear precipitations were regarded as positive. A minimum of 500 cells/slide was analyzed in a high-powered field using a light microscope, and the percentage of positive cells was determined.

Western Blot Analysis.
SCC-25 cells were treated with Scutellaria baicalensis, and the proteins were extracted from the cells using a buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP40, and 1× protease inhibitors (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Fifteen μg of protein were fractionated by electrophoresis through a 10% SDS polyacrylamide gel, and the proteins then transferred onto a nitrocellulose membrane. The membrane was blocked for 1 h in a blocking buffer containing 5% dry milk, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, and 0.1% Tween 20 and then incubated with a polyclonal anti-COX-2 antibody (1:400 dilution; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) in the blocking buffer at 4°C overnight. The membrane was then incubation with an antirabbit antibody conjugated with horseradish peroxidase (Amersham, Arlington Height, IL), and the protein was detected using chemiluminescence method followed by autoradiography. The same membrane was then used to detect β-actin protein using a monoclonal anti-β-actin antibody (1:10,000 dilution; Sigma) as described above.

PGE2 EIA.
A competitive PGE2 EIA was used to quantify the level of PGE2 released into culture media and was performed according to the manufacturer’s instructions (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). The supernatants of control and treated cells were collected, centrifuged at 2500 rpm for 2 min, and stored at −70°C until tested. Fifty μl aliquots of each sample were assayed in triplicate. Absorbance was measured at 450 nm on an ELX800 reader (Bio-Tek Instruments, Inc.). The minimal detectable concentration of PGE2 by the assay is 50 pg/ml. The PGE2 produced is expressed as pg/106 cells.

The effect of celecoxib and Scutellaria baicalensis on COX-2 activity was additionally examined using a cellular arachidonic acid conversion assay. The SCC-25 cells were incubated for 12 h, and the medium was aspirated and replaced with fresh medium containing Scutellaria baicalensis or celecoxib at IC50 concentrations (150 μg/ml for Scutellaria baicalensis or 25 μM for celecoxib). The cells were additionally incubated for various periods of time, and the medium was aspirated. Fresh medium containing 100 μM arachidonic acid (Cayman) was added, and the cells were incubated for additional 30 min. PGE2 in the medium was measured as described above.

Animals and Treatment Protocol.
Six-week-old female nude mice (NCR/NU) were purchased from Taconic (Cincinnati, OH) and received s.c. injections of KB cells (5 × 106) to the right flank. At 2 weeks, tumors reached 300 mm 3 in volume, and mice were randomized into two experimental groups (n = 4). The treatment group was given 1.5 mg/mouse (75 mg/kg) Scutellaria baicalensis extract dissolved in water by oral gavage five times/week for duration of 7 weeks. Mice were weighed, and tumor volume assessed on a weekly basis. Tumor volume was measured by two perpendicular dimensions (long and short) using a caliper and calculated using the formula (a × b2) / 2, where a is the larger and b is the smaller dimension of the tumor.

Previous Section
Next Section
RESULTS

Growth Inhibition of Scutellaria Baicalensis on HNSCC Cell Lines.
The percentage of growth inhibition of different agents on KB and SCC-25 cells was determined as the percentage of viable-treated cells in comparison with viable cells of untreated controls. Scutellaria baicalensis displayed a dose-dependent (Fig. 1A) ⇓ and time-dependent (data not shown) inhibition on the growth of both cell lines. Both cells exhibited equal sensitivity to Scutellaria baicalensis and IC50s of both cell lines were determined to be 150 μg/ml. The maximal inhibition of cell growth (>90%) was achieved at 1500 μg/ml. On the other hand, Scutellaria baicalensis did not inhibit the growth of HaCaT cell, a nontumorigenic oral squamous cell line, even at a concentration of 750 μg/ml (Fig. 1A) ⇓ , indicating that Scutellaria baicalensis selectively inhibited cancer cell growth. We additionally tested and compared the inhibitory effects of indomethacin (nonselective COX inhibitor), celecoxib (COX-2-specific inhibitor), and baicalein, one of the ingredients of Scutellaria baicalensis. The results show that both HNSCC cells are sensitive to these three agents (Fig. 1, B and C) ⇓ . However, celecoxib exhibited stronger growth inhibition (IC50 = 25 μM) than baicalein (IC50 = 75 μM) and indomethacin (IC50 = 75 μM). Time-dependent growth inhibition of both cell lines was observed with maximal growth inhibition between days 3 and 7 depending on the concentra

Kết quả (Việt) 1:

Hóa chất và thuốc.Các chiết xuất nguyên của Scutellaria baicalensis đã được chuẩn bị bởi sôi rễ khô của cây trồng trong nước, theo sau là một quá trình làm khô phun nước chiết xuất. Dạng bột của các chiết xuất được cung cấp bởi Q-loại thảo dược phòng thí nghiệm (New York, NY) và được hòa tan trong trung bình đến 20 mg/ml, vortexed ở nhiệt độ phòng cho 1 phút, và ủ tại 37° C cho 1 h trong khi quay trước khi sử dụng. Giải pháp này ly 5000 rpm cho 10 phút để loại bỏ bất kỳ thành phần không hòa tan. Supernatant được thông qua thông qua một bộ lọc 0,22-μm cho khử trùng và pha loãng với văn hóa phương tiện trước hàm lượng cuối cùng của 1.5-1500 μg/ml Scutellaria baicalensis chiết xuất. Năm mươi mM cổ phần giải pháp baicalein (Sigma, St. Louis, MO) và indomethacin (Sigma) và 10 mM cổ phần giải pháp của celecoxib [SC-58635; 4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1]-benzene-sulfonamide; Searle nghiên cứu và phát triển, St. Louis, MO] đã được chuẩn bị với DMSO (Sigma) và pha loãng với văn hóa phương tiện trước hàm lượng cuối cùng của 5-400 μM. Tế bào kiểm soát nhận được DMSO (0,25%) hoặc văn hóa Trung bình chỉ.Dòng tế bào và mô nền văn hóa.Hai dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào vảy của con người (KB và SCC-25) đã được mua từ Mỹ loại văn hóa bộ sưu tập (Manassas, VA). Lý do của việc sử dụng hai dòng tế bào là ung thư tế bào vảy là một bệnh ung thư không đồng nhất và có thể có một sự khác biệt của họ để đáp ứng với thuốc. Dòng tế bào SCC-25 được bắt nguồn từ ung thư tế bào vảy lưỡi và đã được trồng trong một hỗn hợp 50: 50 DMEM (cuộc sống công nghệ, Inc, Rockville, MD) và F12 (cuộc sống công nghệ, Inc) có chứa 10% FBS (cuộc sống công nghệ, Inc) và 1% kháng sinh-Antimycotic (cuộc sống công nghệ, Inc). KB dòng tế bào được bắt nguồn từ một ung thư tế bào vảy sàn miệng có chứa con người papilloma virus 18 trình tự và được nuôi trong DMEM có chứa 10% FBS và hỗn hợp kháng sinh-Antimycotic 1%. Ngoài ra, một dòng nontumorigenic tế bào vảy uống của con người, HaCaT, đã được sử dụng như một điều khiển để nghiên cứu sự ức chế sự tăng trưởng (19, 20). HaCaT dòng tế bào được vui lòng thu được từ tiến sĩ Jonathon Garlick (State University of New York tại Stony Brook, Stony Brook, NY) và nuôi cấy trong MEM có 10% FBS và 1% hỗn hợp Antimycotic kháng sinh. Dòng tế bào được duy trì ở 37° C trong một bầu không khí ẩm 5% CO2.Các khảo nghiệm khả năng di động.Tỷ lệ tăng trưởng ức chế đã được xác định bằng cách sử dụng một khảo nghiệm MTT (Sigma) để đo lường khả thi tế bào. Tổng cộng 2,5 × 10 3 tế bào/cũng hạt vào một tấm 96-tốt cho 24 h, điều trị bằng các nồng độ khác nhau của Scutellaria baicalensis, baicalein, indomethacin, và celecoxib và ủ cho thêm 3 ngày ở 37° C. Sau đó, 10 μl MTT tại nồng độ của 5 mg/ml đã được bổ sung tốt đến mỗi, và tế bào đã được ủ cho một bổ sung 4-6 h. Supernatant aspirated, và 100 μl của DMSO đã được thêm vào các giếng để hòa tan bất kỳ precipitate hiện nay. Hấp thu sau đó đã được đo tại bước sóng số 570 nm bằng cách sử dụng một trình đọc ELX800 (sinh học-Tek cụ, Inc, Winooski, VT).Phân tích chu kỳ tế bào.Tổng cộng 1.5 × 105 tế bào/cũng được mạ vào 6-cũng tấm và ủ cho 24 h 37° C. Các nồng độ khác nhau của Scutellaria baicalensis, baicalein, indomethacin, và celecoxib đã được thêm vào các giếng và ủ cho thêm 3 ngày. Tế bào đã được sau đó rửa sạch, pelleted, cố định với lạnh 70% ethanol cho ít nhất là 30 phút, và ủ với 100 μg/ml RNase A và 50 μg/ml propidium iođua trong PBS ở nhiệt độ phòng cho 30 phút mẫu được ngay lập tức phân tích bởi cytometry dòng chảy (Becton Dickinson, San Jose, CA). Chu kỳ tế bào giai đoạn phân phối đã được xác định bằng cách sử dụng phần mềm Modfit (Verity phần mềm House, Topsham, ME).Immunohistochemical các phân tích của PCNA biểu hiện.Thu hoạch tế bào đã được áp dụng để bọc polylysine trình bày bởi số tại 800 viên mỗi phút cho 5 phút trong một công cụ Cytospin (Sakura Finetek Mỹ, Torrance, CA). Tế bào là máy sấy khô và cố định trong 100% axeton cho 10 phút ở 4° C. Trang trình bày sau đó đã được ủ với 3% hydrogen peroxide để quench peroxidase nội sinh hoạt động trong 5 phút. Sau khi ba nhà rửa với PBS, trang trình bày đã được ủ với huyết thanh chặn các giải pháp cho 20 phút ở nhiệt độ phòng. Giải pháp blotted, và 2 μg/ml chính chuột chống-PCNA monoclonal kháng thể (công nghệ sinh học Santa Cruz, Santa Cruz, CA) đã được thêm vào. Tế bào sau đó đã được ủ tại 4° C qua đêm. Sau khi ba nhà rửa với PBS, các trang trình bày đã được ủ trong 10 phút với biotinylated dê kháng thể antimouse ở nhiệt độ phòng (phòng thí nghiệm Zymed, San Francisco, CA). Trình bày đã được rửa sạch ba lần nữa với PBS và sau đó ủ cho 10 phút với streptavidin-peroxidase liên hợp ở nhiệt độ phòng (phòng thí nghiệm Zymed). Màu sắc được phát triển bằng cách bổ sung diaminobenzoate chromogen (Zymed phòng thí nghiệm), và trình bày đã được counterstained với hematoxylin. Các tế bào với màu nâu hạt nhân precipitations được coi là tích cực. Tối thiểu là 500 tế bào/trượt được phân tích trong một lĩnh vực cao-powered, bằng cách sử dụng một kính hiển vi ánh sáng, và tỷ lệ phần trăm của các tế bào tích cực đã được xác định.Phân tích phương Tây Blot.Tế bào SCC-25 đã được điều trị với Scutellaria baicalensis, và các protein được chiết xuất từ các tế bào bằng cách sử dụng một bộ đệm chứa 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP40, và ức chế protease 1 × (Roche áp dụng khoa học, Indianapolis, IN). Mười lăm μg protein được fractionated bởi điện thông qua một 10% dùng mũi SDS polyacrylamide gel, và các protein sau đó chuyển vào một màng nitrocellulose. Các màng tế bào bị chặn cho 1 h trong một bộ đệm chặn có 5% sữa bột, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, và 0.1% giữa 20 và sau đó ủ với một kháng thể chống-COX-2 polyclonal (1:400 pha loãng; Hóa chất Cayman, Ann Arbor, MI) trong vùng đệm chặn lúc 4 ° C qua đêm. Các màng tế bào là sau đó ấp trứng với một kháng thể antirabbit kết với cải ngựa peroxidase (Amersham, Arlington cao, IL), và các protein được phát hiện bằng cách sử dụng chemiluminescence phương pháp tiếp theo autoradiography. Các màng tế bào tương tự sau đó được sử dụng để phát hiện β-actin protein bằng cách sử dụng một kháng thể anti-β-actin monoclonal (1:10, 000 pha loãng; Sigma) như mô tả ở trên.PGE2 DỰ ÁN.Một dự án PGE2 cạnh tranh đã được sử dụng để định lượng mức độ PGE2 phát hành vào phương tiện truyền thông văn hóa và được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Amersham Pharmacia công nghệ sinh học, Piscataway, NJ). Supernatants kiểm soát và xử lý các tế bào đã được thu thập, ly 2500 rpm cho 2 phút, và được lưu trữ ở −70 ° C cho đến khi thử nghiệm. Năm mươi μl aliquots của mỗi mẫu đã được assayed trong triplicate. Hấp thu được đo tại 450 nm trên một ELX800 đọc (Bio-Tek cụ, Inc). Nồng độ phát hiện tối thiểu của PGE2 của các khảo nghiệm là 50 pg/ml. PGE2 sản xuất được thể hiện như tế bào pg/106.Tác động của celecoxib và Scutellaria baicalensis COX-2 hoạt động ngoài ra kiểm tra bằng cách sử dụng một khảo nghiệm chuyển đổi axít arachidonic di động. Các tế bào SCC-25 đã được ủ cho 12 h, và các phương tiện được aspirated và thay thế với tươi trung bình chứa Scutellaria baicalensis hoặc celecoxib ở nồng độ IC50 (150 μg/ml cho Scutellaria baicalensis) hoặc 25 μM cho celecoxib. Ngoài ra, các tế bào đã được ủ cho các thời kỳ khác nhau của thời gian, và các phương tiện được aspirated. Tươi trung bình có 100 μM arachidonic acid (Cayman) được bổ sung, và các tế bào đã được ủ cho thêm tối thiểu 30 PGE2 trong các phương tiện đã được đo như mô tả ở trên.Động vật và giao thức điều trị.Six-week-old female nude mice (NCR/NU) were purchased from Taconic (Cincinnati, OH) and received s.c. injections of KB cells (5 × 106) to the right flank. At 2 weeks, tumors reached 300 mm 3 in volume, and mice were randomized into two experimental groups (n = 4). The treatment group was given 1.5 mg/mouse (75 mg/kg) Scutellaria baicalensis extract dissolved in water by oral gavage five times/week for duration of 7 weeks. Mice were weighed, and tumor volume assessed on a weekly basis. Tumor volume was measured by two perpendicular dimensions (long and short) using a caliper and calculated using the formula (a × b2) / 2, where a is the larger and b is the smaller dimension of the tumor.Previous SectionNext SectionRESULTSGrowth Inhibition of Scutellaria Baicalensis on HNSCC Cell Lines.The percentage of growth inhibition of different agents on KB and SCC-25 cells was determined as the percentage of viable-treated cells in comparison with viable cells of untreated controls. Scutellaria baicalensis displayed a dose-dependent (Fig. 1A) ⇓ and time-dependent (data not shown) inhibition on the growth of both cell lines. Both cells exhibited equal sensitivity to Scutellaria baicalensis and IC50s of both cell lines were determined to be 150 μg/ml. The maximal inhibition of cell growth (>90%) was achieved at 1500 μg/ml. On the other hand, Scutellaria baicalensis did not inhibit the growth of HaCaT cell, a nontumorigenic oral squamous cell line, even at a concentration of 750 μg/ml (Fig. 1A) ⇓ , indicating that Scutellaria baicalensis selectively inhibited cancer cell growth. We additionally tested and compared the inhibitory effects of indomethacin (nonselective COX inhibitor), celecoxib (COX-2-specific inhibitor), and baicalein, one of the ingredients of Scutellaria baicalensis. The results show that both HNSCC cells are sensitive to these three agents (Fig. 1, B and C) ⇓ . However, celecoxib exhibited stronger growth inhibition (IC50 = 25 μM) than baicalein (IC50 = 75 μM) and indomethacin (IC50 = 75 μM). Time-dependent growth inhibition of both cell lines was observed with maximal growth inhibition between days 3 and 7 depending on the concentra

Kết quả (Việt) 2:

Hóa chất và thuốc.
Dịch chiết thô của Scutellaria baicalensis đã được chuẩn bị bằng cách đun sôi rễ khô của cây trong nước, tiếp theo là một quá trình sấy phun của các chiết xuất nước. Các dạng bột của các chiết xuất được cung cấp bởi Q Herb-phòng thí nghiệm (New York, NY) và được hòa tan trong môi trường đến 20 mg / ml, vortexed ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, và ủ ở 37 ° C trong 1 giờ trong khi xoay trước dùng. Giải pháp này đã được ly tâm ở 5000 rpm trong 10 phút để loại bỏ bất kỳ thành phần không hòa tan. Các dịch nổi được đưa qua một bộ lọc 0,22-micron để tiệt trùng và pha loãng với môi trường nuôi cấy để có nồng độ 1,5-1500 mg / ml Scutellaria baicalensis trích. Năm mươi giải pháp chứng khoán mM baicalein (Sigma, St. Louis, MO) và indomethacin (Sigma) và 10 mM dung dịch của celecoxib [SC-58.635; 4- [5 (4-metylphenyl) -3- (triflometyl) -1H-pyrazol-1] -benzene-sulfonamide; Nghiên cứu và Phát triển Searle, St. Louis, MO] đã được chuẩn bị với DMSO (Sigma) và pha loãng với môi trường nuôi cấy để có nồng độ 5-400 mM. Tế bào kiểm soát nhận DMSO (0,25%) hoặc môi trường nuôi cấy chỉ. Các dòng di động và Văn Hóa Tissue. Hai vảy dòng nhân ung thư tế bào tế bào (KB và SCC-25) được mua từ Mỹ Loại Collection Văn hóa (Manassas, VA). Lý do căn bản của việc sử dụng hai dòng tế bào ung thư là tế bào vảy là một loại ung thư không đồng nhất và có thể có một sự khác biệt trong phản ứng của họ đối với thuốc. SCC-25 dòng tế bào được bắt nguồn từ ung thư biểu mô tế bào vảy và lưỡi được trồng trong một hỗn hợp 50:50 của DMEM (Technologies Life, Inc., Rockville, MD) và F12 (Technologies Life, Inc) có chứa 10% FBS (Life Technologies , Inc.) và 1% kháng sinh chống nấm-(Life Technologies, Inc.). Dòng tế bào KB được bắt nguồn từ một tầng ung thư biểu mô tế bào vảy miệng có chứa vi rút u nhú ở người 18 trình tự và được nuôi trong DMEM có chứa 10% FBS và hỗn hợp kháng sinh chống nấm-1%. Ngoài ra, một con người bằng miệng dòng tế bào vảy nontumorigenic, HaCaT, đã được sử dụng như một điều khiển để nghiên cứu ức chế tăng trưởng (19, 20). Dòng tế bào HaCaT được vui lòng thu được từ Tiến sĩ Jonathon Garlick (Đại học bang New York tại Stony Brook, Stony Brook, NY) và nuôi cấy trong MEM ​​có chứa 10% FBS và hỗn hợp kháng sinh chống nấm-1%. Dòng tế bào được duy trì ở 37 ° C trong một bầu không khí ẩm có 5% CO2. Di Khả năng tồn Assay. Tỷ lệ ức chế tăng trưởng được xác định bằng cách sử dụng một MTT (Sigma) khảo nghiệm để đo tế bào sống. Có tổng cộng 2,5 × 10 3 tế bào / giếng đã được gieo vào một tấm 96 giếng trong 24 h, điều trị với nồng độ khác nhau của Scutellaria baicalensis, baicalein, indomethacin, và celecoxib, và ủ thêm 3 ngày ở 37 ° C. Sau đó, 10 ml MTT ở nồng độ 5 mg / ml đã được thêm vào từng giếng, và các tế bào được ủ thêm 4-6 h. Các dịch nổi được hút, và 100 ml DMSO đã được thêm vào các giếng để hòa tan bất kỳ hiện kết tủa. Độ hấp thụ sau đó được đo ở bước sóng 570 nm sử dụng một đọc ELX800 (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT). Cell Cycle Analysis. Có tổng cộng 1,5 × 105 tế bào / giếng được mạ lên 6 cũng tấm và ủ trong 24 giờ ở 37 ° C. Nồng độ khác nhau của Scutellaria baicalensis, baicalein, indomethacin, và celecoxib đã được thêm vào các giếng và ủ thêm 3 ngày. Sau đó các tế bào được rửa sạch, ăn viên, cố định với lạnh 70% ethanol trong ít nhất 30 phút, và ủ với 100 microgam / ml RNase A và 50 mg / ml propidium iodide trong PBS ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Các mẫu được phân tích ngay lập tức bởi dòng cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA). Phân phối giai đoạn chu kỳ tế bào được xác định bằng cách sử dụng phần mềm Modfit (Verity Software House, Topsham, ME). Miễn dịch Phân tích PCNA Expression. Tế bào thu hoạch đã được áp dụng vào các slide polylysine bọc bằng ly tâm ở 800 rpm trong 5 phút trong một công cụ Cytospin (Sakura Finetek USA , Torrance, CA). Các tế bào được không khí khô và cố định ở 100% acetone trong 10 phút ở nhiệt độ 4 ° C. Slides sau đó được ủ với 3% hydrogen peroxide để làm dịu cơn hoạt động peroxidase nội sinh trong 5 phút. Sau ba rửa với PBS, slide được ủ với giải pháp ngăn chặn huyết thanh trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Giải pháp đã được xoá nhoà, và 2 mg / ml đơn dòng chuột chính chống PCNA kháng thể (Santa Cruz Công nghệ sinh học, Santa Cruz, CA) đã được thêm vào. Các tế bào này sau đó được ủ ở nhiệt độ 4 ° C qua đêm. Sau ba rửa với PBS, các slide được ủ trong 10 phút với dê biotinylated kháng thể antimouse ở nhiệt độ phòng (Zymed phòng thí nghiệm, San Francisco, CA). Slides được rửa ba lần với PBS và sau đó ủ trong 10 phút với streptavidin-peroxidase liên hợp ở nhiệt độ phòng (Zymed Laboratory). Màu sắc đã được phát triển bởi việc bổ sung các chất nhiễm sắc diaminobenzoate (Zymed Laboratory), và các slide được counterstained với hematoxylin. Tế bào với lượng mưa hạt nhân màu nâu đã được coi là tích cực. Một tối thiểu là 500 tế bào / slide đã được phân tích trong một trường cao-powered sử dụng một kính hiển vi ánh sáng, và tỷ lệ phần trăm của các tế bào dương tính đã được xác định. Western Blot phân tích. SCC-25 tế bào được điều trị bằng Scutellaria baicalensis, và các protein được chiết xuất từ các các tế bào bằng cách sử dụng một bộ đệm chứa 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP40, và 1 × chất ức chế protease (Roche Khoa học ứng dụng, Indianapolis, IN). Mười lăm mg protein đã được phân đoạn bằng điện thông qua một 10% SDS polyacrylamide gel, và các protein sau đó được chuyển vào một màng nitrocellulose. Màng đã bị chặn trong 1 h trong một bộ đệm chặn có chứa sữa khô 5%, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, và 0,1% Tween 20 và sau đó ủ với một đa giá chống COX-2 kháng thể (1 : 400 pha loãng; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) trong bộ đệm chặn ở 4 ° C qua đêm. Màng sau đó đã được ủ với một kháng thể antirabbit liên hợp với cải ngựa peroxidase (Amersham, Arlington Chiều cao, IL), và các protein được phát hiện bằng cách sử dụng phương pháp Chemiluminescence tiếp theo autoradiography. Màng cùng sau đó được sử dụng để phát hiện các protein β-actin sử dụng một anti-β-actin kháng thể đơn dòng. (1: 10.000 pha loãng; Sigma) như mô tả ở trên PGE2 EIA. Một cạnh tranh PGE2 EIA đã được sử dụng để định lượng mức độ PGE2 phát hành vào phương tiện truyền thông và văn hóa được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Các nước nổi của các kiểm soát và điều trị các tế bào đã được thu thập, ly tâm ở 2500 rpm trong 2 phút, và bảo quản ở -70 ° C cho đến khi thử nghiệm. Năm mươi phần phân ước ml mỗi mẫu được khảo nghiệm trong ba lần. Độ hấp thụ được đo ở 450 nm vào một trình đọc ELX800 (Bio-Tek Instruments, Inc.). Nồng độ phát hiện tối thiểu của PGE2 bằng xét nghiệm là 50 pg / ml. PGE2 sản xuất được thể hiện như pg / 106 tế bào. Các tác dụng của celecoxib và Scutellaria baicalensis trên COX-2 hoạt động đã được kiểm tra bổ sung bằng cách sử dụng một chuyển đổi axit arachidonic xét nghiệm tế bào. SCC-25 tế bào được ủ trong 12 h, và trung bình được hút và thay thế bằng trung tươi có chứa Scutellaria baicalensis hoặc celecoxib ở nồng độ IC50 (150 mcg / ml cho Scutellaria baicalensis hoặc 25 mM cho celecoxib). Các tế bào được ủ thêm cho giai đoạn khác nhau của thời gian, và vừa được hút. Vừa tươi có chứa 100 mM axit arachidonic (Cayman) đã được bổ sung, và các tế bào được ủ thêm 30 phút. PGE2 trong môi trường được đo như mô tả ở trên. Động vật và Phác đồ điều trị. Chuột khỏa thân nữ Sáu tuần tuổi (NCR / NU) được mua từ Taconic (Cincinnati, OH) và được tiêm sc của các tế bào KB (5 × 106) để cánh phải. Vào lúc 2 tuần, khối u đạt 300 mm 3 về khối lượng, và những con chuột được chia ngẫu nhiên thành hai nhóm thực nghiệm (n = 4). Các nhóm điều trị đã được đưa ra 1,5 mg / chuột (75 mg / kg) Scutellaria baicalensis chiết xuất hòa tan trong nước bằng cách đưa thức ăn uống năm lần / tuần trong thời gian 7 tuần. Chuột được cân nặng, và tích khối u đánh giá trên cơ sở hàng tuần. Tích khối u được đo bằng hai chiều vuông góc (dài và ngắn) bằng cách sử dụng một caliper và tính theo công thức (một b2 ×) / 2, trong đó một là lớn hơn và b là kích thước nhỏ hơn của các khối u. Phần trước Phần Tiếp Kết quả tăng trưởng Ức chế Scutellaria Baicalensis trên HNSCC dòng di động. Tỷ lệ ức chế tăng trưởng các đại lý khác nhau trên KB và SCC-25 tế bào được xác định là tỷ lệ phần trăm của các tế bào sống được điều trị so với các tế bào sống của các điều khiển không được điều trị. Scutellaria baicalensis hiển thị một (1A Fig.) Phụ thuộc vào liều ⇓ và phụ thuộc thời gian (dữ liệu không hiển thị) ức chế sự tăng trưởng của cả hai dòng tế bào. Cả hai tế bào nhạy trưng bày bằng Scutellaria baicalensis và IC50s của cả hai dòng tế bào được xác định là 150 mg / ml. Sự ức chế tối đa sự phát triển của tế bào (> 90%) đạt được ở 1500 mg / ml. Mặt khác, Scutellaria baicalensis không ức chế sự tăng trưởng của tế bào HaCaT, một miệng dòng tế bào vảy nontumorigenic, thậm chí ở nồng độ 750 mg / ml (Fig. 1A) ⇓, chỉ ra rằng Scutellaria baicalensis tăng trưởng tế bào ung thư có chọn lọc ức chế. Chúng tôi đã thử nghiệm thêm và so sánh hiệu quả ức chế của indomethacin (ức chế không chọn lọc COX), celecoxib (chất ức chế COX-2-cụ thể), và baicalein, một trong những thành phần của Scutellaria baicalensis. Kết quả cho thấy rằng cả hai tế bào HNSCC rất nhạy cảm với các tác nhân ba (Hình. 1, B và C) ⇓. Tuy nhiên, celecoxib trưng bày ức chế sự tăng trưởng mạnh (IC50 = 25 mM) hơn baicalein (IC50 = 75 mM) và indomethacin (IC50 = 75 mM). Ức chế sự tăng trưởng phụ thuộc thời gian của cả hai dòng tế bào đã được quan sát với sự ức chế tăng trưởng tối đa giữa ngày 3 và 7 phụ thuộc vào concentra