1. IntroductionThe rhizome ofAnemar

1. Introduction
The rhizome of
Anemarrhenae asphodeloides
Bge (Liliaceae) has been
known to exhibit anti-diabetic activity [1], platelet aggregation activity [2] and
diuretic activity [3], and has been widely used in Chinese and Japanese folk
medicine. Chemical constituents of the rhizome have been studied by several
groups, and the isolation and identification of one of these constituents, steroidal
saponin, has been reported [2,4–7]. Two novel steroidal saponins, timosaponins
E1 and E2, were prepared previously [8,9] from the rhizome of
Anemarrhenae
asphodeloides
Bge according to the methods reported by Saito et al. [10].
However, the pharmaceutical effect of these compounds on platelet aggregation
was not investigated. Superoxide generation in human neutrophils is stimulated
during phagocytosis and by treatment of cells with various stimuli, such as
certain chemoattractants and activators of protein kinase [11–14]. However,
resting neutrophils in the blood circulation are poorly responsive to agonists.
Neutrophil function can be primed by a variety of pro-inflammatory stimuli
[15–20]. When the cells are exposed to priming agents, such functions as
respiratory burst, phagocytosis and degranulation are greatly enhanced. How-
ever, the mechanism of such priming has not been clearly defined. Therefore, in
the present study, we investigated the effects of two novel steroidal saponins
isolated from
Anemarrhenae rhizoma
, and found that they had an inhibitory
effect on platelet aggregation, as well as various effects on stimulus-induced
superoxide generation in human neutrophils.
2. Materials and methods
2.1.
Chemicals
NADPH, ferricytochrome
c
(cyt.
c
), superoxide dismutase,
N
-formyl–
methionyl–leucyl–phenylalanine (fMLP), arachidonic acid (AA) and phorbol
12-myristate 13-acetate (PMA) were purchased from Sigma (St. Louis, MO,
USA). Genistein was from Wako Pure Chemicals (Osaka, Japan). The APTT
assay kit was purchased from Dade International (Aguade, PR, USA). All other
N
.
Kaname et al
.
/
Clinica Chimica Acta
295 (2000) 129
–
140
131
reagents used were of analytical grade and were purchased from Nacalai Tesque
(Osaka, Japan) unless otherwise stated. Timosaponins E1 and E2 were isolated
from
Anemarrhenae asphodeloides
Bge according to the methods of Zhiyun
Meng et al., as reported in previous papers [8,9].
2.2.
Isolation of neutrophils
Human peripheral blood polymorphonuclear leukocytes (HPPMNs) were
isolated from the peripheral blood of healthy humans by Ficoll-Hypaque (Flow
Laboratories) density gradient centrifugation [21] and were washed twice with
Krebs–Ringer–phosphate solution, pH 7.4 (KRP) [22]. The cells were counted
8
and resuspended in KRP at a concentration of 1
3
10 cells / ml.
2.3.
Assay of superoxide generation
Superoxide generation was assayed by measuring the reduction of cyt.
c
at
37
8
C using a dual-beam spectrophotometer (Shimadzu UV-3000; Shimadzu,
Kyoto, Japan) under constant stirring conditions [23]. The standard assay
6
mixture consisted of 1
3
10 cells / ml, 1 mmol / l CaCl , 20 mmol / l cyt.
c
,10
2
mmol / l glucose, 0–50 mmol / l steroidal saponin and a stimulus (12.5 nmol / l
fMLP, 1 nmol / l PMA or 10 mmol / l AA) in a final volume of 2 ml of KRP.
After preincubation for 3 min with a steroidal saponin, the reaction was started
by adding a stimulus and the absorbance change at 550–540 nm (
D
A)was
550–540
monitored for 5 min.
2.4.
Detection of tyrosyl phosphorylation of neutrophil proteins
6
Neutrophils (1
3
10 cells / ml) were incubated in 1 ml of KRP containing 1
mmol / l CaCl , 10 mmol / l glucose and 0–100 mmol / l of timosaponins E1 and
2
E2 for 3 min at 37
8
C, and then 0.5 ml of ice-cold 45% trichloroacetic acid (final
concentration, 15%) containing 1 mmol / l sodium vanadate and 2 mmol / l
phenylmethylsulfonylfluoride was added to stop the reaction. After incubation
for 30 min at 4
8
C, the mixture was centrifuged at 10,000
g
for 15 min at 4
8
C.
The precipitate was washed twice with ice-cold diethyl ether–ethanol (1:1, v / v),
dissolved in 50 ml of 62.5 mmol / l Tris–HCl (pH 6.8) containing 2% sodium
dodecyl sulfate (SDS), 0.7 mol / l
b
-mercaptoethanol and 10% glycerol and was
subjected to SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE) using a
7.5% gel [24]. The electrophoresed proteins were transferred onto Immobilon-P
membranes (Nippon Millipore) using a semidry blotting apparatus (Sartorius)
2
for 60 min at 2 mA / cm , and the tyrosyl phosphorylated proteins were detected
using phosphotyrosine-specific monoclonal antibody (PY-20; ICN Biochemi-
132
N
.
Kaname et al
.
/
Clinica Chimica

Kết quả (Việt) 1:

1. giới thiệuThân rễ củaAnemarrhenae asphodeloidesBGE (Liliaceae) đãđược biết đến để triển lãm hoạt động chống bệnh tiểu đường [1], tiểu cầu tập hợp hoạt động [2] vàthuốc lợi tiểu hoạt động [3], và đã được sử dụng rộng rãi trong dân gian Trung Quốc và Nhật bảny học. Các thành phần hóa học của thân rễ đã được nghiên cứu bởi một sốNhóm, và cô lập và nhận dạng của một trong các thành phần, steroidsaponin, đã là báo cáo [2,4-7]. Hai tiểu thuyết steroid saponin, timosaponinsE1 và E2, đã được chuẩn bị trước đó [8,9] từ thân rễ củaAnemarrhenaeasphodeloidesBGE theo phương pháp báo cáo bởi Saito et al. [10].Tuy nhiên, tác động dược phẩm của các hợp chất này kết tập tiểu cầuChưa được nghiên cứu. Superoxide thế hệ trong bạch cầu trung tính của con người được kích thíchtrong phagocytosis và điều trị của các tế bào với kích thích khác nhau, chẳng hạn nhưnhất định chemoattractants và tính protein kinase [11-14]. Tuy nhiên,nghỉ ngơi bạch cầu trung tính trong máu lưu thông đáp ứng kém với variandole.Bạch cầu trung tính chức năng có thể được sơn lót bởi một loạt các pro-viêm kích thích[15-20]. Khi các tế bào được tiếp xúc với đại lý mồi, như vậy có chức năng nhưhô hấp burst, phagocytosis và quá được tăng cường rất nhiều. Làm thế nào-bao giờ hết, cơ chế mồi như vậy đã không được xác định rõ ràng. Vì vậy, trongnghiên cứu hiện tại, chúng tôi điều tra tác động của hai tiểu thuyết saponinbị cô lập từAnemarrhenae rhizoma, và thấy rằng họ đã có một ức chếcó hiệu lực vào kết tập tiểu cầu, cũng như nhiều hiệu ứng trên gây ra kích thíchsuperoxide các thế hệ trong bạch cầu trung tính của con người.2. tài liệu và phương pháp2.1.Hóa chấtNADPH, ferricytochromec(cyt.c), superoxide dismutase,N-formyl-methionyl-leucyl-nmol (fMLP), acid arachidonic (AA) và phorbol12-myristate 13-axetat (PMA) đã được mua từ Sigma (St. Louis, MO,HOA KỲ). Genistein là từ Wako hoá chất tinh khiết (Osaka, Nhật bản). APTTkhảo nghiệm kit đã được mua từ Dade International (Aguade, PR, Hoa Kỳ). Tất cả cácN.Kaname et al./Acta Clinica Chimica295 (2000) 129–140131thử sử dụng là phân tích lớp và đã được mua từ Nacalai Tesque(Osaka, Nhật bản) trừ khi được nêu. Timosaponins E1 và E2 bị cô lậptừAnemarrhenae asphodeloidesBGE theo phương pháp ZhiyunMeng et al., theo báo cáo trong giấy tờ trước [8,9].2.2.Sự cô lập của bạch cầu trung tínhMáu ngoại vi polymorphonuclear leukocytes (HPPMNs) đãbị cô lập từ máu ngoại vi của con người khỏe mạnh bởi Ficoll-Hypaque (dòng chảyPhòng thí nghiệm) mật độ gradient số [21] và đã được rửa sạch hai lần vớiKrebs-chuoâng-phosphate giải pháp, pH 7.4 (KRP) [22]. Các tế bào được đếm8và resuspended trong KRP tại nồng độ của 1310 các tế bào / ml.2.3.Các khảo nghiệm của superoxide thế hệSuperoxide thế hệ được assayed bằng cách đo lường giảm cyt.ctại378C bằng cách sử dụng một phối kép-chùm (Shimadzu UV-3000; Shimadzu,Kyoto, Nhật bản) theo liên tục khuấy điều kiện [23]. Các khảo nghiệm tiêu chuẩn6hỗn hợp bao gồm 1310 các tế bào / ml, 1 mmol / l CaCl, 20 mmol / l cyt.c, 102mmol / l glucose, 0-50 mmol / l steroid saponin và một kích thích (12,5 nmol / lfMLP, 1 nmol / l PMA hoặc 10 mmol / l AA) trong một tập cuối cùng của 2 ml KRP.Sau khi preincubation trong 3 phút với một steroid saponin, phản ứng đã được bắt đầubằng cách thêm một kích thích và hấp thu thay đổi tại 550-540 nm)DA)550-540theo dõi cho 5 phút.2.4.Phát hiện tyrosyl phosphorylation protein bạch cầu trung tính6Bạch cầu trung tính (1310 các tế bào / ml) đã được ủ trong 1 ml KRP có 1mmol / l CaCl, 10 mmol / l glucose và các 0-100 mmol / l timosaponins E1 và2E2 cho 3 phút tại 378C, và sau đó là cách 0.5 ml lạnh 45% Axit tricloaxetic (trận chung kếttập trung, 15%) có 1 mmol / l natri vanadat và 2 mmol / lphenylmethylsulfonylfluoride đã được bổ sung để ngăn chặn phản ứng. Sau khi ấptrong 30 phút 48C, hỗn hợp được ly tại 10.000gtrong 15 phút 48C.Precipitate được rửa sạch hai lần với lạnh diethyl ête-ethanol (1:1, v / v),giải tán năm 50 ml 62.5 mmol / l Tris-HCl (pH 6.8) có chứa 2% natridodecyl sulfate (dùng mũi SDS), cách 0.7 mol / lbNhóm glycerol - mercaptoethanol và 10% vàphải chịu sự dùng mũi SDS-polyacrylamide gel điện (dùng mũi SDS-trang) sử dụng một7,5% gel [24]. Electrophoresed protein được chuyển vào Immobilon-Pmàng (Nippon Millipore) bằng cách sử dụng một bộ máy thấm nên (Sartorius)2trong 60 phút tại 2 mA / cm, và protein tyrosyl phosphorylated đã được phát hiệnbằng cách sử dụng cụ thể phosphotyrosine monoclonal kháng (PY-20; ICN Biochemi-132N.Kaname et al./Clinica Chimica

Kết quả (Việt) 2:

1. Giới thiệu
Thân rễ của
Anemarrhenae asphodeloides
BGE (họ loa kèn) đã được
biết đến để triển lãm các hoạt động chống đái tháo đường [1], hoạt động kết tập tiểu cầu [2] và
lợi tiểu [3], và đã được sử dụng rộng rãi trong dân gian Trung Quốc và Nhật Bản
thuốc. Thành phần hóa học của thân rễ đã được nghiên cứu bởi nhiều
nhóm, và sự cô lập và nhận dạng của một trong các thành phần này, steroid
saponin, đã được báo cáo [2,4-7]. Hai saponin steroid cuốn tiểu thuyết, timosaponins
E1 và E2, đã được chuẩn bị trước đó [8,9] từ thân rễ của
Anemarrhenae
asphodeloides
BGE theo các phương pháp báo cáo của Saito et al. [10].
Tuy nhiên, tác dụng dược phẩm của các hợp chất trên kết tập tiểu cầu
đã không điều tra. Thế hệ superoxide trong bạch cầu trung tính con người được kích thích
trong quá trình thực bào và các tế bào bằng cách xử lý với các kích thích khác nhau, chẳng hạn như
một số chemoattractants và kích hoạt các protein kinase [11-14]. Tuy nhiên,
bạch cầu trung tính nghỉ ngơi trong lưu thông máu kém đáp ứng với các thuốc đồng vận.
Chức năng Neutrophil có thể được sơn lót bởi một loạt các kích thích gây viêm
[15-20]. Khi các tế bào tiếp xúc với các tác nhân mồi, các chức năng như
nổ hô hấp, thực bào và degranulation được tăng cường rất nhiều. Làm thế nào-
bao giờ hết, các cơ chế mồi như vậy chưa được xác định rõ ràng. Vì vậy, trong
nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của hai saponin steroid cuốn tiểu thuyết
cô lập từ
Anemarrhenae
Rhizoma, và thấy rằng họ đã có một ức chế
tác dụng trên tiểu cầu kết tập, cũng như các hiệu ứng khác nhau về kích thích gây ra
hệ superoxide trong bạch cầu trung tính của con người.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1.
Hóa chất
NADPH, ferricytochrome
c
(cyt.
C), superoxide dismutase, N -formyl- methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), acid arachidonic (AA) và phorbol 12-Myristate 13-acetate (PMA) đã được mua từ Sigma (St. Louis, MO, USA). Genistein là từ Wako Hóa chất tinh khiết (Osaka, Nhật Bản). Các APTT kit xét nghiệm đã được mua từ Dade International (Aguade, PR, USA). Tất cả các khác N. Kaname et al. / Clinica Chimica Acta 295 (2000) 129 - 140 131 Các chất phản ứng được sử dụng là các phân tích và được mua từ Nacalai Tesque (Osaka, Nhật Bản), trừ khi có quy định khác. Timosaponins E1 và E2 được phân lập từ Anemarrhenae asphodeloides BGE theo các phương pháp của Zhiyun Meng et al., Theo báo cáo trong các giấy tờ trước [8,9]. 2.2. Phân lập bạch cầu trung tính bạch cầu đa nhân trong máu ngoại vi ở người (HPPMNs) được phân lập từ các thiết bị ngoại vi máu của người khỏe mạnh bởi Ficoll-Hypaque (Flow Laboratories) mật độ Gradient ly tâm [21] và đã được rửa sạch hai lần với giải pháp Krebs-Ringer-phosphate, pH 7.4 (KRP) [22]. Các tế bào được tính 8 và lơ lửng trong KRP ở nồng độ 1 3 10 tế bào / ml. 2.3. Khảo nghiệm của thế hệ superoxide hệ Superoxide đã được khảo nghiệm bằng cách đo sự giảm cyt. C ở 37 8 C bằng cách sử dụng một máy quang phổ dual-beam (Shimadzu UV-3000; Shimadzu, Kyoto, Nhật Bản) trong điều kiện khuấy liên tục [23]. Các tiêu chuẩn khảo nghiệm 6 hỗn hợp gồm 1 3 10 tế bào / ml, 1 mmol / l CaCl, 20 mmol / l cyt. C, 10 2 / l glucose mmol, 0-50 mmol / l steroid saponin và một kích thích (12,5 nmol / l fMLP, 1 nmol / l PMA hoặc AA 10 mmol / l) trong một thể tích cuối cùng của 2 ml KRP. Sau preincubation trong 3 phút với một saponin steroid, các phản ứng đã được bắt đầu bằng cách thêm một sự kích thích và sự thay đổi độ hấp thụ ở 550 540 nm (D A) được 550-540 theo dõi trong 5 phút. 2.4. Phát hiện tyrosyl phosphoryl hóa các protein bạch cầu trung tính 6 Bạch cầu trung tính (1 3 10 tế bào / ml) được ủ trong 1 ml KRP chứa 1 mmol / l CaCl, 10 mmol / l glucose và 0-100 mmol / l của timosaponins E1 và 2 E2 trong 3 phút ở 37 8 C, và sau đó 0,5 ml 45% axit băng lạnh tricloaxetic (thức tập trung, 15%) có chứa 1 mmol / l natri vanadate và 2 mmol / l phenylmethylsulfonylfluoride đã được bổ sung để ngăn chặn các phản ứng. Sau khi ủ trong 30 phút ở 4 8 C, hỗn hợp được ly tâm ở 10.000 g trong 15 phút ở 4 8 C. Kết tủa được rửa sạch hai lần với nước đá lạnh diethyl ether-ethanol (1: 1, v / v), hòa tan trong 50 ml 62,5 mmol / l Tris-HCl (pH 6.8) có chứa 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0,7 mol / l b -mercaptoethanol và 10% glycerol và đã chịu SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) sử dụng một gel 7,5% [24]. Các protein electrophoresed đã được chuyển lên Immobilon-P màng (Nippon Millipore) bằng cách sử dụng một bộ máy blotting semidry (Sartorius) 2 cho 60 phút ở 2 mA / cm, và tyrosyl protein được phosphoryl hóa đã được phát hiện bằng cách sử dụng pyruvate-cụ thể kháng thể đơn dòng (PY-20; ICN Biochemi- 132 N. Kaname et al. / Clinica Chimica