B. Homogenate PreparationCYP1A enzy

B. Homogenate Preparation
CYP1A enzymes are localized mainly in the
membrane of the endoplasmic reticulum. Isolation
and purification of enzymes for EROD analysis
consist of homogenization of the excised tissues
(mortar and pestle or sonication) and two centrifugation
steps to isolate fragments of the endoplasmic
reticulum known as the microsomes (Pohl and Fouts,
1980). Current recommendations are that livers remain
frozen until enzyme assays are conducted, and
that the microsome preparation and the EROD assay
be conducted on the same day (Melancon, 1996).
Liver samples must be kept on ice and centrifugation
must be conducted at 4°C to prevent the loss of
enzymatic activity prior to measurement (Burke and
Mayer, 1974). Hepatic tissues are first thawed and
then homogenized in ice-cold buffer (e.g., sucrose-
Tris, phosphate, pH 7.4). Dithiothreitol (1 mM) is
sometimes included in the buffer to prevent CYP1A
inactivation (Nebbia et al., 1999). A minimal volume
of buffer (1 to 2 volumes of the liver sample) should
be used for effective homogenization (e.g., 1 ml,
Melancon, 1996). The homogenate is then centrifuged
at 9000 to 11,000 × g for 20 to 25 min to yield
a postmitochondrial supernatant (PMS or S9 fraction).
Some investigations measure EROD activity
in the homogenate or in the PMS, but most protocols
suggest further centrifugation of the PMS at 100,000-
200,000 × g for 50 to 60 min to yield a microsomal
pellet. The microsomal pellet is resuspended in buffer.
Microsomal suspensions typically yield EROD activity
3- to 5-fold greater than those measured in
either the raw liver homogenate or the PMS. However,
the induction of EROD relative to controls
appears to be fairly similar between the homogenate
and PMS (Balk et al., 1982; James et al., 1988;
Munkittrick et al., 1993; O’Hare et al., 1995a). The
liver subcellular fraction (homogenate, PMS, or microsomal
suspension) should be maintained on ice
and EROD activity should be measured within 3 h
(Pluta, 1995).

Kết quả (Việt) 1:

Sinh chuẩn bị HomogenateCYP1A enzyme được bản địa hoá chủ yếu trong cácmàng của mạng lưới. Cô lậpvà thanh lọc của các enzym để phân tích ERODbao gồm homogenization mô excised(vữa và pestle hoặc sonication) và hai sốCác bước để cô lập các mảnh vỡ của các endoplasmiclưới được gọi là microsomes (Pohl và Fouts,1980). khuyến nghị hiện tại là rằng gan vẫnđông lạnh cho đến khi enzyme thử nghiệm được tiến hành, vàchuẩn bị microsome và EROD khảo nghiệmđược thực hiện trong cùng một ngày (Melancon, 1996).Gan mẫu phải được giữ trên băng và sốphải được tiến hành tại 4° C để ngăn chặn sự mất mát củaCác hoạt động enzyme trước khi đo lường (Burke vàMayer, 1974). Mô gan được xả đá đầu tiên vàsau đó homogenized trong bộ đệm lạnh (ví dụ như, sucrose-Tris, phosphate, pH 7.4). Dithiothreitol (1 mM) làđôi khi gộp trong bộ đệm để ngăn chặn CYP1Angừng hoạt động (Nebbia và ctv., 1999). Một khối lượng tối thiểuđệm (1-2 khối lượng của gan mẫu) nênđược sử dụng cho hiệu quả homogenization (ví dụ như, 1 ml,Melancon, 1996). Homogenate sau đó ly9000 để 11.000 × g cho 20-25 phút để mang lạipostmitochondrial supernatant (PMS hoặc S9 phần nhỏ).Điều tra một số đo lường hoạt động ERODtrong homogenate hoặc trong PMS, nhưng hầu hết các giao thứcđề nghị thêm số của PMS tại 100.000-200.000 × g cho 50 đến 60 phút để mang lại một microsomalmiếng. Miếng microsomal resuspended trong bộ đệm.Microsomal đình chỉ thường mang lại hoạt động EROD3 - để 5 - fold lớn hơn những người được đo bằnghomogenate gan nguyên hoặc các PMS. Tuy nhiên,cảm ứng của EROD liên quan đến điều khiểndường như là khá tương tự như giữa homogenatevà PMS (Balk et al., 1982; James et al., 1988;Munkittrick et al., 1993; O'Hare et al., 1995a). Cácphần nhỏ của gan (homogenate, PMS, hoặc microsomalHệ thống treo) nên được duy trì trên băngvà EROD hoạt động nên được đo trong 3 h(Pluta, 1995).

Kết quả (Việt) 2:

B. Chuẩn bị đồng chất
enzyme CYP1A khu trú chủ yếu ở
màng lưới nội chất. Phân lập
và tinh sạch enzyme để phân tích EROD
bao gồm đồng nhất của các mô cắt
(cối và chày hoặc sonication) và hai ly tâm
bước để cô lập những mảnh vỡ của endoplasmic
reticulum gọi là microsomes (Pohl và Fouts,
1980). Khuyến nghị hiện tại đang là gan vẫn
đóng băng cho đến khi xét nghiệm enzyme được tiến hành, và
rằng việc chuẩn bị vi thể và các xét nghiệm EROD
được tiến hành trong cùng một ngày (Melancon, 1996).
mẫu gan phải được lưu giữ trên băng và ly tâm
phải được tiến hành ở 4 ° C để ngăn chặn sự mất mát của các
hoạt động enzym trước khi đo (Burke và
Mayer, 1974). Mô gan được đầu tan ra và
sau đó được đồng nhất trong bộ đệm băng lạnh (ví dụ, sucrose-
Tris, phosphate, pH 7,4). Dithiothreitol (1 mM) là
đôi khi bao gồm trong bộ đệm để ngăn chặn CYP1A
bất hoạt (Nebbia et al., 1999). Một khối lượng tối thiểu
của bộ đệm (1-2 khối lượng của mẫu gan) nên
được sử dụng cho hiệu quả đồng nhất (ví dụ, 1 ml,
Melancon, 1996). Các đồng chất sau đó được ly tâm
ở 9000 đến 11.000 × g trong 20 đến 25 phút để mang lại
một bề postmitochondrial (PMS hoặc S9 phần).
Một số hoạt động điều tra EROD biện pháp
trong đồng chất hoặc trong PMS, nhưng hầu hết các giao thức
đề nghị ly tâm hơn nữa của PMS tại 100.000
200.000 × g trong 50 đến 60 phút để mang lại một microsome
viên. Các viên microsome đang lơ lửng trong bộ đệm.
microsome đình chỉ hoạt động thường mang EROD
3 đến 5 lần lớn hơn so với những người được đo bằng
một trong hai đồng chất gan sống hoặc PMS. Tuy nhiên,
cảm ứng của EROD liên quan đến điều khiển
dường như là khá giống nhau giữa các đồng chất
và PMS (Balk et al, 1982;. James et al, 1988;.
Munkittrick et al 1993,;.. O'Hare et al, 1995) . Các
phần dưới tế bào gan (đồng chất, PMS, hoặc microsome
treo) nên được duy trì trên băng
hoạt động và EROD nên được đo trong vòng 3 h
(Pluta, 1995).