PROCEDURECloning target-specific sg

PROCEDURE
Cloning target-specific sgRNA oligos into sgRNA scaffold vectors for transient expression in protoplasts ● TIMING 4 d
1| Dilute each forward and reverse target-specific sgRNA oligos to a final concentration of 10 µM. Prepare the following
mixture to anneal the sgRNA oligos:
Component Amount (ml) Final
Annealing buffer, 10× 2 1×
Rice-Fwd or Wheat-Fwd (10 µM) 9 4.5 µM
Rice-Rev or Wheat-Rev (10 µM) 9 4.5 µM
Total 20
2| Anneal the oligos in a thermocycler using the following conditions:
Cycle number Condition
1 95 °C, 5 min
2 95–25 °C, −1 °C min−1, 70 min
3 10 °C, Hold
3| Digest the appropriate scaffold plasmid (pOsU3-sgRNA for rice, pTaU6-sgRNA for wheat) with AarI in a 50-µl reaction
mixture, as tabulated below:
Component Amount (ml) Final
AarI buffer (supplied with AarI), 10× 5 1×
Oligonucletide (supplied with AarI), 50× 1 1×
AarI, 2 U µl−1 2 4 units
pOsU3-sgRNA or pTaU6-sgRNA Variable 2 µg
ddH2O To 50 —
4| Incubate the digestion reaction at 37 °C for 3–16 h.
 CRITICAL STEP A longer incubation time is better.
5| Run the digested product on a 1.2% (wt/vol) agarose gel in TAE buffer using standard protocols. A successful digestion
reaction should yield a single 3.2-kb band for pOsU3-sgRNA or a single 2.9-kb band for pTaU6-sgRNA.
6| Cut out the band under UV light and purify the vector DNA with a gel purification kit.
 PAUSE POINT The purified vector DNA can be stored at −20 °C for several months.
7| Ligate the annealed sgRNA oligos (from Step 2) into the digested vector. We recommend also setting up a
no-insert-vector-only negative control for ligation. Set up the following reaction and incubate it at 22 °C for 1 h:
Component Amount (ml) Final
T4 ligation buffer, 10× 1 1×
Digested vector (Step 6) Variable 50 ng
Annealed sgRNA oligos (Step 2) 3
T4 ligase, 5 U µl−1 0.5 2.5 units
ddH2O To 10

Kết quả (Việt) 1:

THỦ TỤCNhân bản vô tính cụ thể mục tiêu sgRNA oligos thành sgRNA đài vectơ cho các biểu hiện thoáng qua trong protoplasts ● thời gian 4 d1 | Pha loãng mỗi chuyển tiếp và đảo ngược mục tiêu cụ thể sgRNA oligos để cuối cùng nồng độ 10 μm. chuẩn cho những điều sau đâyhỗn hợp để trui thép sgRNA oligos:Thành phần số lượng (ml) cuối cùngỦ đệm, 10 × 2 1 ×Fwd gạo hoặc lúa mì-Fwd (10 μm) 9 4,5 μmRev gạo hoặc lúa mì-Rev (10 μm) 9 4,5 μmTất cả 202 | Trui thép oligos trong một thermocycler bằng cách sử dụng các điều kiện sau đây:Tình trạng số chu kỳ1 95 ° C, 5 phút2 95-25 ° C, min−1 ° C −1, 70 phút3 10 ° C, tổ chức3 | Tiêu hóa đài thích hợp plasmid (pOsU3 – sgRNA gạo, pTaU6-sgRNA cho lúa mì) với AarI trong một phản ứng 50 mlhỗn hợp, như tabulated dưới đây:Thành phần số lượng (ml) cuối cùngAarI đệm (được cung cấp với AarI), 10 × 5 1 ×Oligonucletide (được cung cấp với AarI), 50 × 1 1 ×AarI, 2 U µl−1 2 4 đơn vịpOsU3-sgRNA hoặc pTaU6-sgRNA µg biến 2ddH2O-50-4 | Ấp cho nở phản ứng tiêu hóa ở 37 ° C với 3 – 16 h. BƯỚC quan trọng một thời gian ủ lâu hơn là tốt hơn.5 | Chạy được các sản phẩm tiêu hóa trên một gel agarose 1,2% (wt/vol) trong vùng đệm TAE sử dụng tiêu chuẩn giao thức. Tiêu hóa thành côngphản ứng nên năng suất một 3,2-kb ban nhạc duy nhất cho pOsU3-sgRNA hoặc một ban nhạc 2,9-kb duy nhất cho pTaU6-sgRNA.6 | Cắt ra các ban nhạc dưới ánh sáng UV và tinh chế vectơ ADN với một bộ lọc gel. tạm dừng điểm tinh khiết vectơ ADN có thể được lưu trữ ở nhiệt độ-20 ° C trong vài tháng.7 | Ligate oligos annealed sgRNA (từ bước 2) thành vector tiêu hóa. Chúng tôi khuyên bạn cũng thiết lập mộtNo-chèn-véc tơ-chỉ tiêu cực điều khiển ligation. Thiết lập phản ứng và ấp cho nở ở 22 ° C cho 1 h:Thành phần số lượng (ml) cuối cùngT4 ligation đệm, 10 × 1 1 ×Tiêu hóa vector (bước 6) biến 50 ngAnnealed sgRNA oligos (bước 2) 3T4 ligase, 5 U µl−1 cách 0.5 2.5 đơn vịddH2O-10

Kết quả (Việt) 2:

THỦ TỤC
Nhân bản oligos sgRNA mục tiêu cụ thể vào các vectơ giàn giáo sgRNA cho biểu hiện thoáng qua trong tế bào trần ● THỜI GIAN 4 d
1 | Pha loãng mỗi phía trước và ngược oligos sgRNA mục tiêu cụ thể đến một nồng độ cuối cùng của 10 mM. Chuẩn bị những điều sau đây
hỗn hợp để bám vào oligos sgRNA:
Số tiền Component (ml) Final
đệm deo, 10 × 2 1 ×
Rice-Fwd hoặc lúa mì-Fwd (10 mM) 9 4.5 mM
Rice-Rev hoặc lúa mì-Rev (10 mM) 9 4.5 mM
Tổng cộng 20
2 | Bám các oligos trong một thermocycler sử dụng các điều kiện sau:
số Cycle Điều kiện
1 95 ° C, 5 phút
2 95-25 ° C, -1 ° C min-1, 70 phút
3 10 ° C, giữ
3 | Digest plasmid giàn giáo thích hợp (pOsU3-sgRNA cho gạo, pTaU6-sgRNA cho lúa mì) với AarI trong một phản ứng 50-ml
hỗn hợp, như lập bảng dưới đây:
Số tiền Component (ml) Final
AarI đệm (cung cấp với AarI), 10 × 5 1 ×
Oligonucletide (cung cấp với AarI), 50 × 1 × 1
AarI, 2 U ml-1 2 4 đơn vị
pOsU3-sgRNA hoặc pTaU6-sgRNA Variable 2 mg
ddH2O 50 -
4 | Ủ các phản ứng thủy phân ở 37 ° C trong 3-16 h.
 BƯỚC QUAN TRỌNG Một thời gian ủ bệnh dài hơn là tốt hơn.
5 | Chạy các sản phẩm tiêu hóa trên 1,2% (wt / vol) gel agarose trong TAE đệm sử dụng các giao thức chuẩn. Một tiêu hóa thành công
phản ứng nên năng suất một ban nhạc 3,2 kb duy nhất cho pOsU3-sgRNA hoặc một ban nhạc 2,9 kb duy nhất cho pTaU6-sgRNA.
6 | Cắt băng dưới ánh sáng tia cực tím và tinh chế DNA vector với một bộ lọc gel.
 PAUSE POINT DNA vector tinh khiết có thể được lưu trữ ở -20 ° C trong vài tháng.
7 | Ligate các oligos sgRNA ủ (từ bước 2) vào vector tiêu hóa. Chúng tôi khuyên bạn cũng thiết lập một
không-chèn-vector chỉ kiểm soát âm tính với thắt. Thiết lập các phản ứng sau và ủ nó ở 22 ° C trong 1 giờ:
Số tiền Component (ml) Final
T4 thắt đệm, 10 × 1 1 ×
tiêu hóa vector (Bước 6) Biến 50 ng
AnnealedBông sgRNA oligos (Bước 2) 3
T4 ligase , 5 U ml-1 0,5 2,5 đơn vị
ddH2O Để 10