Materials and Methods Preparation o

Materials and Methods
Preparation of meat mixtures
Tissue from the skeletal muscle of chicken( Gallus gallus), turkey ( Meleagris gallopavo) horse (Equus caballus), donkey (Equus asinus), pork (Sus scrofa domesticus), cattle (Bos taurus), and sheep (Ovis aries) were used. Binary meat mixtures, containing chicken and turkey meat ranging from 0.001% to 10% levels (corresponding range of 0.001 to 10 ng target DNA), were prepared within a beef mixture. To eliminate errors that usually occur during blending, beef was added to the mixture at a level of approximately 50% in each batch and blended for 2 min to obtain a thoroughly homogeneous meat mixture each time when the target meats were diluted in the mixtures. Patties of approximately 20 g were prepared at every level of the binary mixtures and were subjected to 3 different heat treatments at 100, 150, and 200 ◦C for 30min in the oven after being covered with aluminium foil. Afterwards, DNA isolation was carried out on the raw and oven-cooked samples.
DNA isolation
To obtain a representative specimen, approximately 10 to 15g raw and oven-cooked patty samples and pure meats from each species investigated were sampled in screw-top grinding jars and then powdered by using a mixer mill (Restch MM400, Germany) with a vibrational frequency of 30 Hz for 5 min after storing at –80 ◦C overnight. The DNA was extracted from 25 mg of the powdered samples using a commercial kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to manufacturer’s protocol and the DNA concentration was measured by the spectrophotometric method (Heptinstall and Rapley 2002).
Oligonucleotide primers and probes
Chicken and turkey specific primers and probe sets were de-signed using the mitochondrial ND2 ( NADH dehydrogenase sub-unit 2) gene DNA sequence following the alignment of available sequences from the GenBank database with Clustal W (version 1.8). (Higgins and others 1992) (Figure 1). In addition, common sense and antisense primers and a probe set that was common to both mammalian and poultry were used to amplify a conserved region of 74 bp of the 16 sRNA gene to act as a control of amplificability and false negativity on the PCR results (Kesmen and others 2009). Primers and probes, labelled 5-carboxyfluorescein (FAM) and 3 fluorescent quencher (TAMRA), were purchased from Metabion (Martinsried, Germany).
Real-time PCR assay
The TaqMan PCR reaction was performed in a final volume of 25 μL using 12.5 μL of Quantitect Probe PCR mix (Qiagen),

Kết quả (Việt) 1:

Vật liệu và phương pháp Chế tạo hỗn hợp thịt Mô từ cơ xương gà (Gallus gallus), Thổ Nhĩ Kỳ (Meleagris gallopavo) ngựa (Equus nhà), lừa (Equus asinus), thịt lợn (Sus scrofa domesticus), bò (Bos taurus) và cừu (Ovis aries) đã được sử dụng. Hỗn hợp thịt nhị phân, có thịt gà và gà tây thịt khác nhau, từ 0,001% đến 10% mức (phạm vi tương ứng của mục tiêu của 0,001-10 DNA), đã được chuẩn bị trong một hỗn hợp thịt bò. Để loại bỏ các lỗi thường xảy ra trong trộn, thịt bò đã được thêm vào hỗn hợp ở mức khoảng 50% trong mỗi lô và pha trộn cho 2 phút để có được một hỗn hợp đồng nhất triệt để thịt mỗi thời gian khi các loại thịt mục tiêu đã được pha loãng trong các hỗn hợp. Patties của khoảng 20 g đã được chuẩn bị ở mọi cấp độ của hỗn hợp nhị phân và đã phải chịu để điều trị nhiệt khác nhau 3 tại 100, 150 và 200 ◦C trong 30 phút vào lò nướng sau khi được che phủ bằng nhôm lá mỏng. Sau đó, cô lập DNA được thực hiện trên các mẫu nguyên và nấu chín lò nướng.Cô lập DNA Để có được một mẫu đại diện, khoảng 10-15g nguyên và nấu chín lò patty mẫu và các loại thịt tinh khiết từ mỗi loài điều tra được lấy mẫu trong vít-đầu mài lọ và sau đó bột bằng cách sử dụng một nhà máy trộn (Restch MM400, Đức) với một tần số vibrational của 30 Hz cho 5 phút sau khi lưu trữ tại –80 ◦C qua đêm. DNA được chiết xuất từ 25 mg của bột mẫu bằng cách sử dụng một bộ thương mại (Qiagen, Hilden, Đức) theo giao thức của nhà sản xuất và nồng độ DNA đã được đo bằng phương pháp spectrophotometric (Heptinstall và Rapley năm 2002).Oligonucleotide chất nền, mồi và đầu dò Gà và Thổ Nhĩ Kỳ specific chất nền, mồi và thăm dò bộ de-đã được ký kết bằng cách sử dụng ti thể ND2 (NADH dehydrogenaza tiểu đơn vị 2) gen trình tự ADN sau liên kết chuỗi có sẵn từ cơ sở dữ liệu GenBank với Clustal W (Phiên bản 1,8). (Higgins và những người khác năm 1992) (Hình 1). Ngoài ra, phổ biến ý thức và antisense chất nền, mồi và bộ thăm dò đã được phổ biến cho cả hai mammalian và gia cầm được sử dụng để khuyếch đại một khu vực bảo tồn của 74 bp của gen sRNA 16 để hoạt động như một điều khiển của amplificability và sai tiêu cực trên các kết quả Đảng Cộng sản Romania (Kesmen và những người khác năm 2009). Chất nền, mồi và đầu dò, dán nhãn 5-carboxyfluorescein (FAM) và 3 fluorescent quencher (TAMRA), đã được mua từ Metabion (Martinsried, Đức).Thời gian thực Đảng Cộng sản Romania khảo nghiệm Phản ứng TaqMan Đảng Cộng sản Romania được thực hiện trong một tập ngoài của 25 μL sử dụng 12,5 μL của hỗn hợp Quantitect thăm dò Đảng Cộng sản Romania (Qiagen),

Kết quả (Việt) 2:

Vật liệu và phương pháp
chuẩn bị các hỗn hợp thịt
Tissue từ các cơ xương của gà (Gallus gallus), gà tây (meleagris gallopavo) Ngựa (Equus caballus), lừa (Equus asinus), thịt lợn (Sus scrofa domesticus), gia súc (Bos taurus), và cừu (Ovis aries) đã được sử dụng. Hỗn hợp thịt nhị phân, có chứa thịt gà và thịt gà tây từ 0,001% đến 10% mức (phạm vi tương ứng của ,001-10 ng DNA mục tiêu), đã được chuẩn bị trong vòng một hỗn hợp thịt bò. Để loại bỏ các lỗi thường xảy ra trong quá trình trộn, thịt bò đã được thêm vào hỗn hợp ở mức xấp xỉ 50% trong mỗi mẻ và pha trộn trong 2 phút để có được một hỗn hợp thịt thật chín đồng nhất mỗi khi các loại thịt mục tiêu đã được pha loãng trong hỗn hợp. Bánh rán nhỏ khoảng 20 g đã được chuẩn bị ở mọi cấp độ của hỗn hợp nhị phân và đã phải chịu 3 phương pháp điều trị khác nhau ở nhiệt độ 100, 150, và 200 ◦C cho 30 phút trong lò sau khi được phủ bằng lá nhôm. Sau đó, cô lập DNA được thực hiện trên các mẫu nguyên liệu và lò nấu.
phân lập DNA
Để có được một mẫu đại diện, khoảng 10 đến 15g mẫu patty liệu và lò nấu chín và thịt nguyên chất từ mỗi loài điều tra đã được lấy mẫu trong lọ vít-top mài và sau đó nghiền thành bột bằng cách sử dụng một máy trộn (Restch MM400, Đức) với một tần số rung động của 30 Hz cho 5 phút sau khi lưu trữ ở -80 ◦C qua đêm. DNA được chiết xuất từ 25 mg của các mẫu bột sử dụng một bộ thương mại (Qiagen, Hilden, Đức) theo giao thức của nhà sản xuất và nồng độ DNA được đo bằng phương pháp quang phổ (Heptinstall và Rapley 2002).
mồi oligonucleotide và thăm dò
gà và gà tây fi Speci mồi c và bộ dò đã được de-ký sử dụng ND2 ty lạp thể (NADH dehydrogenase sub-unit 2) trình tự DNA gen sau sự liên kết của các trình tự có sẵn từ các cơ sở dữ liệu GenBank với Clustal W (phiên bản 1.8). (Higgins và những người khác 1992) (Hình 1). Ngoài ra, cảm giác thông thường và sơn lót antisense và một bộ dò mà là chung cho cả động vật có vú và gia cầm đã được sử dụng để khuếch đại một khu vực được bảo vệ của 74 bp của gen 16 Srna để hoạt động như một điều khiển của ampli cability fi và tiêu cực sai về kết quả PCR ( Kesmen và những người khác 2009). Mồi và đầu dò, có nhãn 5-carboxy fl uorescein (FAM) và 3 fl uorescent khuẩn (Tamra), được mua từ Metabion (Martinsried, Đức).
PCR thời gian thực
Các phản ứng TaqMan PCR được thực hiện trong một thể tích fi nal 25 ml bằng 12,5 ml của hỗn hợp Quantitect Probe PCR (Qiagen),