ACTA BIOLOGICA CRACOVIENSIA Series

ACTA BIOLOGICA CRACOVIENSIA Series Botanica 47/2: 23–26, 2005






BREAKING SEED DORMANCY IN BLACK MULBERRY

(MORUS NIGRA L.) BY COLD STRATIFICATION AND EXOGENOUS

APPLICATION OF GIBBERELLIC ACID


FATMA KOYUNCU*

Department of Horticulture, Süleyman Demirel University, 32260 Isparta, Turkey

Received October 10, 2004; revision accepted March 30, 2005

Experiments were done to determine the effects of cold stratification (0, 20, 40, 60, 80 or 100 days), application of gibberelic acid (GA3) (0, 250, 500, 1000 or 2000 mg/l) and the combination (GA3 + stratification) on seed germination of black mulberry. Application of 1000 mg/l GA3 proved more effective than any of the other concentrations of GA3 applied. Seeds stratified for 100 days showed 88% germination. The combined treatment of 250 mg/l GA3 and 100 days of stratification yielded 96% germination of seeds. The relationships between GA3 concentration and seed germination (r = 0.93), and between stratification duration and seed germination (r = 0.91) of black mulberry were linear.

Key words: Dormancy, black mulberry, germination, gibberellic acid, stratification.



INTRODUCTION

Seeds are of importance for propagating seedling root-stocks on which to graft or bud varieties, and for obtaining hybrid plants in breeding studies (Westwood, 1995; Hartmann et al., 1997). Whether or not a viable seed germinates and the time at which it does so depend on a number of factors, including factors in the seed’s environment (Bewley and Black, 1994). Seed germination is influenced by internal factors control-ling dormancy, including phytohormones (e.g., abscisic acid) inducing dormancy, and by seed coat factors (seed coat-enhanced dormancy) (for review: Bewley, 1997). Dry seeds of most temperate trees and shrubs, even though mature, will not germinate and grow until they been imbibed to threshold moisture content under cold conditions (0–5˚C) (cold stratification) (Hartmann et al., 1997). The dormancy of dormant seeds must be broken to induce germination. Various methods are used for this, depending on the plant species and type of dormancy. Chilling plays an important role in pro-viding the stimulus required to overcome dormancy, increase germination, and produce normal seedlings for Prunus persica cv. GF305 (Martinez-Gomez and Dicenta, 2001), strawberry tree (Karam and Al-Salem, 2001) and Prunus avium (Jensen and Eriksen, 2001). Exogenous growth regulator treatments – gibberellins



(usually gibberellic acid GA3 and GA4+7) and cytokinins (usually kinetin, benzyladenine) – have been shown to break dormancy in many seed species (Dweikat and Lyrene, 1988; Karam and Al-Salem, 2001; Mehanna et al., 1985).

There have been some studies of the germination ability of M. alba seeds (Petkov, 1995), but apparently almost no work has been done on M. nigra seeds. The objective of this study was to investigate the effect of stratification, gibberellic acid (GA3) and combination treatments (GA3 + stratification) on germination of black mulberry seeds. The experiments were conducted twice over a 2-year period with consistent results. The data presented here are from the second experimental year.



MATERIALS AND METHODS

Black mulberry (Morus nigra L.) fruits were harvested when ripe in August 2002 from the Egirdir Horticultu-ral Research Institute, Isparta (Turkey). The fruits were soaked in water for 24 h and then the seeds were extracted by hand, washed, dried in the shade for two days, surface-sterilized in 1% aqueous NaOCl solution for 5 min, and then rinsed with distilled water three times. In the stratification procedure (moist chilling),


*e-mail: [e-mail]


PL ISSN 0001-5296 © Polish Academy of Sciences, Cracow 2005




24 Koyuncu





























Fig. 1. Germination percentage and mean germination time (MGT) of black mulberry seeds under different stratification durations (a) and GA3 concentrations (b). Seeds were incubated at 25˚C in the dark, and germinating seeds were counted daily for 14 days. Bars followed by different letters differ significantly according to Duncan’s multiple range test at p = 0.01.



seeds were placed on filter paper moistened with dis-tilled water in 10 cm diameter Petri dishes and stored in a refrigerator at 4  1˚C for 0, 20, 40, 60, 80 or 100 days. In the gibberellic acid treatments, seeds were imbibed in solutions of GA3 (0, 250, 500, 1000 or 2000 mg/l) for 24 h. The other pregermination treatments were arranged as a 4 (GA3 concentration)  6 (stratifi-cation duration) factorial test. Seeds were imbibed with GA3 (250, 500, 1000 or 2000 mg/l) and stratified for 0, 20, 40, 60, 80 or 100 days. Gibberellic acid was pur-chased from Sigma. In the germination experiments, seeds of all treatments were placed on filter paper moistened with 3% N-(trichloromethyl) thio-4-cyclo-hexene–1,2-dicarboximide (Captan) to control fungal attack in Petri dishes, and incubated at 25  1˚C in the dark. Moisture was maintained with distilled water. Germination was counted every day for 14 days. A seed with at least a 2 mm long radicle was considered to be germinated. Germination percentage was calculated as the average of four replicates of 50 seeds, and the mean germination time (MGT) was calculated according to the formula in Bewley and Black (1994):

MGT= Σ(t.n)/Σn

where t is the time in days starting from day 0 to the end of the germination test, and n is the number of seeds completing germination on day t.



Statistical analyses were performed with general linear models (GLM) (SPSS ver. 10, SPSS Inc., U.S.A.). Percentage data were subjected to arcsin transforma-tion and ANOVA was performed. Differences among means were analyzed by Duncan’s multiple range test at p = 0.01. Germination percentage values were corre-lated using linear regressions.



RESULTS AND DISCUSSION

Stratification had a significant effect on seed germina-tion of black mulberry (p < 0.01). Non-stratified seeds gave only 33% germination, whereas seeds stratified for 100 days gave 88% germination (Fig. 1a). Increasing the duration of stratification from 0 to 100 days re-sulted in up to a 164% increase in germination. A linear equation best described the relationship between the cumulative percentage of germination and the dura-tion of stratification (r = 0.9, p < 0.05) (Fig. 1a). Strati-fication might act simply to lower the rate of enzymatic reactions taking place in the seed, and might cause differential changes in enzyme concentrations or in enzyme production (Bewley and Black, 1994). Seeds of strawberry tree (Arbutus andrachne L.) stratified at 4˚C for 12 weeks had 86% germination (Karam and Al-Salem, 2001). In a study of 18 different shrub




Breaking seed dormancy in Morus nigra L. 25























Fig. 2. Effect of GA3 and stratification from 0 to 100 days on germination of black mulberry seeds. Seeds were soaked in 250, 500, 1000 or 2000 mg/l solutions of GA3, and then stratified. Seeds were incubated at 25˚C in the dark, and germinating seeds were counted daily for 14 days. Bars followed by different letters differ significantly according to Duncan’s multiple range test at p = 0.01.



species, moist pre-chilling yielded maximum germina-tion (Stidham et al., 1980). Koyuncu and Sesli (2000) reported that 125 days of stratification had a signifi-cant effect on the germination percentage of Juglans regia L. nuts. These reports and our results show that stratification is successful in breaking seed dormancy, though the duration of treatment may vary with the species.

Pre-treatment with GA3 significantly enhanced germination of non-stratified black mulberry seeds (p < 0.01). GA3 treatments at 1000 and 2000 mg/l con-centrations yielded the highest germination percent-age (60–67%; Fig. 1b). Increasing the concentration of GA3 resulted in an increase in germination percentage. Regressions indicated that the germination rate had a highly significant positive correlation with the GA3 con-centrations (r = 0.93, p < 0.05; Fig. 1b). GA3 has been found to be effective in increasing germination in several species and to break dormancy in dormant seeds. Pre-treatment of blueberry seeds with GA4+7 at 100–500 mg/l accelerated germination (Ballington, 1984). Arbu-tus andrachne L. (eastern strawberry tree) seeds treated with 250 mg/l GA3 had 86% germination (Karam and Al-Salem, 2001). It has been reported that germination can be induced by gibberellic acid in Vac-cinium myrtillus L. (Giba et al., 1993), Vaccinium corymbosum L. (Dweikat and Lyrene, 1988) and Fagus sylvatica (Nicolás et al., 1996) seeds. These results confirm that GA3 treatment enhances seed germination.

Mean germination time (MGT) decreased with increasing duration of stratification and concentration of GA3 (Fig. 1a,b), indicating that dormancy can be suppressed by moist chilling and exogenous GA3 appli-



cation. MGT is related to dormancy intensity (Jensen and Eriksen, 2001). The measure of MGT in the present study was measured as the time needed to release dormancy and initiate radicle growth.

The combined treatment with GA3 + stratification had a statistically significant effect on germination (Fig. 2). Seeds treated with 250 mg/l GA3 without stratification gave 35% germination, whereas seeds treated with 250 mg/l GA3 + 100 day stratification gave 96% germination. Increasing the stratification period from 0 to 100 days at 250 mg/l GA3 resulted in up to a 174% increase in germination. A significant (p < 0.01) interaction effect of GA3 concentration and duration of stratification was found. Seed dormancy in some species may be due to insufficient development of the embryo, chemical inhibition, or the failure of chemical reactions that make food reserves in the seed available to the developing embryo (Hilhorst and Karssen, 1992; Karam and Al-Salem, 2001). Physiological dormancy in seeds is dependent on the ratio of the levels of abscisic acid (a growth inhibit

Kết quả (Việt) 1:

ACTA BIOLOGICA CRACOVIENSIA loạt Botanica 47/2:23-26, 2005


phá vỡ hạt giống ngu trong màu đen MULBERRY

(MORUS NIGRA L.) BỞI sự phân tầng lạnh và ngoại sinh

các ứng dụng của axít GIBBERELLIC


FATMA KOYUNCU *

vùng làm vườn, Süleyman Demirel University, 32260 Isparta, Thổ Nhĩ Kỳ

nhận được 10 tháng 10 năm 2004; Phiên bản chấp nhận ngày 30 tháng 3 năm 2005

Thí nghiệm đã được thực hiện để xác định tác động của sự phân tầng lạnh (0, 20, 40, 60, 80 hoặc 100 ngày), ứng dụng của gibberelic axit (tên gọi GA3) (0, 250, 500, 1000 hoặc 2000 mg/l) và sự kết hợp (tên gọi GA3 phân tầng) trên hạt nảy mầm của đen dâu. Các ứng dụng của 1000 mg/l tên gọi GA3 đã chứng minh hiệu quả hơn so với bất kỳ các nồng độ khác của tên gọi GA3 áp dụng. Hạt phân tầng trong 100 ngày cho thấy 88% nảy mầm. Điều trị kết hợp 250 mg/l tên gọi GA3 và 100 ngày của sự phân tầng mang lại 96% nảy mầm của hạt giống. Các mối quan hệ giữa nồng độ GA3 và hạt nảy mầm (r = 0,93), và giữa sự phân tầng thời gian và hạt nảy mầm (r = 0.91) trong màu đen mulberry là tuyến tính.

từ khóa: ngu, đen mulberry, nảy mầm, Axít gibberellic, sự phân tầng.



giới thiệu

hạt giống có tầm quan trọng cho tuyên truyền cây giống gốc-cổ phiếu mà trên đó để ghép hoặc bud giống, và cho việc thu thập hybrid nhà máy trong chăn nuôi nghiên cứu (Westwood, 1995; Hartmann et al., 1997). Có hay không một hạt giống khả thi germinates và thời gian mà tại đó nó vì vậy không phụ thuộc vào một số yếu tố, Các yếu tố bao gồm cả trong môi trường của hạt giống (Bewley và đen, 1994). Hạt nảy mầm chịu ảnh hưởng của các yếu tố nội bộ kiểm soát linh ngu, bao gồm phytohormon (ví dụ như, abscisic acid) gây ra ngu, và của hạt giống áo yếu tố (hạt giống áo tăng cường ngu) (để xem xét: Bewley, 1997). Khô hạt đặt ôn đới và cây bụi, ngay cả mặc dù trưởng thành, sẽ không nảy mầm và phát triển cho đến khi họ được imbibed đến nội dung độ ẩm ngưỡng dưới điều kiện lạnh (0-5˚C) (lạnh phân tầng) (Hartmann và ctv., 1997). Ngu không hoạt động hạt giống phải được chia để tạo ra nảy mầm. Phương pháp khác nhau được sử dụng cho việc này, tùy thuộc vào các loài thực vật và loại ngu. Lạnh đóng một vai trò quan trọng trong pro-viding kích thích yêu cầu để vượt qua ngu, tăng nảy mầm, và sản xuất cây thông thường cây giống cho Prunus persica var. GF305 (Martinez-Gomez và Dicenta, 2001), dâu tây (Karam và Al-Salem, 2001) và Prunus avium (Jensen và Eriksen, 2001). Ngoại sinh tăng trưởng điều trị-gibberellin



(thường Axít gibberellic GA3 và GA4 7) và cytokinins (thường kinetin, benzyladenine)-đã được chứng minh để phá vỡ ngu trong nhiều hạt giống loài (Dweikat và Lyrene, năm 1988; Karam và Al-Salem, năm 2001; Mehanna et al., 1985).

đã có một số nghiên cứu khả năng nảy mầm của hạt giống M. alba (Petkov, 1995), nhưng dường như hầu như không có công việc đã được thực hiện trên M. nigra hạt giống. Mục tiêu của nghiên cứu này là để điều tra ảnh hưởng của sự phân tầng, Axít gibberellic (tên gọi GA3) và kết hợp phương pháp điều trị (tên gọi GA3 phân tầng) trên nảy mầm của hạt giống mulberry màu đen. Các thí nghiệm được tiến hành hai lần trong một khoảng thời gian 2 năm với kết quả phù hợp. Các dữ liệu trình bày ở đây là từ năm thứ hai thử nghiệm.


vật liệu và phương pháp

đen mulberry (Morus nigra L.) trái cây đã được thu hoạch khi chín tháng 8 năm 2002 từ viện nghiên cứu Horticultu-ral Egirdir, Isparta (Thổ Nhĩ Kỳ). Các loại trái cây được ngâm trong nước cho 24 h và sau đó các hạt đã được chiết xuất bằng tay, rửa sạch, khô trong bóng râm cho hai ngày, khử trùng bề mặt trong 1% NaOCl giải pháp dung dịch nước cho 5 phút, và sau đó rinsed với nước chưng cất nước ba lần. Trong các thủ tục phân tầng (ẩm ướt lạnh),


* e-mail: [e-mail]


PL ISSN 0001-5296 © Ba Lan viện Khoa học, Cracow 2005



24 Koyuncu


hình 1. Tỷ lệ phần trăm nảy mầm và thời gian có nghĩa là nảy mầm (MGT) của hạt giống màu đen mulberry dưới thời hạn khác nhau phân tầng (a) và tên gọi GA3 nồng độ (b). Hạt giống đã được ủ tại 25˚C trong bóng tối, và nảy hạt giống đã được tính hàng ngày cho 14 ngày. Quán bar theo chữ cái khác nhau khác nhau một cách đáng kể theo của Duncan nhiều phạm vi thử nghiệm tại p = 0,01.



hạt giống đã được đặt trên giấy lọc ẩm với nước dis-cày trong 10 cm đường kính Petri món ăn và lưu trữ trong tủ lạnh tại 4  1˚C cho 0, 20, 40, 60, 80 hoặc 100 ngày. Trong phương pháp điều trị Axít gibberellic, hạt giống đã được imbibed trong các tên gọi GA3 (0, 250, 500, 1000 hoặc 2000 mg/l) cho 24 h. Các pregermination phương pháp điều trị khác được bố trí như là một  (tên gọi GA3 nồng độ) 4 6 (stratifi-cation thời gian) thử nghiệm giai thừa. Hạt giống đã được imbibed với tên gọi GA3 (250, 500, 1000 hoặc 2000 mg/l) và phân tầng cho 0, 20, 40, 60, 80 hoặc 100 ngày. Axít gibberellic là pur đuổi từ Sigma. Trong các thí nghiệm nảy mầm, hạt giống của tất cả các phương pháp điều trị đã được đặt trên giấy lọc ẩm với 3% N-(trichloromethyl) thio-4-cyclo-hexene-1,2-dicarboximide (Captan) để kiểm soát các tấn công nấm trong món ăn Petri, và ủ tại 25  1˚C trong bóng tối. Độ ẩm được duy trì với nước cất. Nảy mầm được đếm mỗi ngày trong 14 ngày. Một hạt giống với ít nhất một radicle dài 2 mm được coi là để được nảy mầm. Tỷ lệ phần trăm nảy mầm đã được tính toán như là trung bình của bốn sao chép của 50 hạt giống, và thời gian có nghĩa là nảy mầm (MGT) được tính theo công thức trong Bewley và đen (1994):

MGT = Σ (thiem) / Σn

nơi t là thời gian trong ngày bắt đầu từ ngày 0 đến đầu của thử nghiệm nảy mầm, và n là số hạt nảy mầm trên ngày t. hoàn tất



phân tích thống kê đã được thực hiện với mô hình tuyến tính tổng quát (GLM) (SPSS ver. 10, SPSS Inc, U.S.A.). Dữ liệu tỷ lệ phần trăm đã phải chịu để arcsin transforma-tion và ANOVA được thực hiện. Sự khác biệt giữa các phương tiện được phân tích bởi Duncan của nhiều phạm vi thử nghiệm tại p = 0,01. Nảy mầm tỷ lệ phần trăm giá trị được corre-lated sử dụng tuyến tính regressions.


kết quả và thảo luận

phân tầng có một tác động đáng kể trên hạt giống germina-tion của đen mulberry (p < 0,01). Phân tầng phòng không hạt giống đã nảy mầm 33% duy nhất, trong khi phân tầng trong 100 ngày hạt giống đã nảy mầm 88% (hình 1a). Tăng thời gian của sự phân tầng từ 0 đến 100 ngày re-sulted trong lên đến một sự gia tăng 164% nảy mầm. Một phương trình tuyến tính tốt nhất mô tả mối quan hệ giữa tích lũy tỷ lệ nảy mầm và màng cứng-tion của sự phân tầng (r = 0,9, p < 0,05) (hình 1a). Strati-fication có thể hành động đơn giản chỉ để giảm tỷ lệ của các phản ứng enzym diễn ra trong các hạt giống, và có thể gây ra những thay đổi khác biệt ở nồng độ enzym hoặc sản xuất enzyme (Bewley và đen, 1994). Hạt giống cây dâu tây (Arbutus andrachne L.) phân tầng tại 4˚C cho 12 tuần đã nảy mầm 86% (Karam và Al-Salem, 2001). Trong một nghiên cứu của 18 cây bụi khác nhau



phá vỡ hạt giống ngu trong Morus nigra L. 25


hình 2. Ảnh hưởng của tên gọi GA3 và sự phân tầng từ 0 đến 100 ngày nảy mầm của hạt giống màu đen dâu. Hạt giống đã được ngâm trong 250, 500, 1000 hoặc 2000 mg/l giải pháp của tên gọi GA3, và sau đó phân tầng. Hạt giống đã được ủ tại 25˚C trong bóng tối, và nảy hạt giống đã được tính hàng ngày cho 14 ngày. Quán bar theo chữ cái khác nhau khác nhau đáng kể theo của Duncan nhiều phạm vi thử nghiệm tại p = 0,01.



loài, ẩm trước lạnh mang lại tối đa germina-tion (Stidham và ctv., 1980). Koyuncu và Sesli (2000) báo cáo rằng 125 ngày kể từ ngày sự phân tầng có ảnh hưởng signifi-không thể nảy mầm, lệ Juglans regia L. hạt. Các báo cáo và kết quả của chúng tôi cho thấy rằng sự phân tầng là thành công trong việc phá vỡ hạt giống ngu, mặc dù thời gian điều trị có thể khác nhau với các loài.

Các điều trị trước với tên gọi GA3 đáng kể nâng cao nảy mầm của hạt giống không phân tầng đen mulberry (p < 0,01). Tên gọi GA3 phương pháp điều trị tại 1000 và 2000 mg/l côn-centrations mang lại cao nhất nảy mầm phần trăm-tuổi (60-67%; Hình 1b). Tăng nồng độ của tên gọi GA3 dẫn đến sự gia tăng trong tỷ lệ phần trăm nảy mầm. Regressions chỉ ra rằng tỷ lệ nảy mầm đã có một mối tương quan tích cực rất quan trọng với tên gọi GA3 côn-centrations (r = 0,93, p < 0,05; Hình 1b). Tên gọi GA3 đã được tìm thấy là có hiệu quả trong việc tăng nảy mầm ở nhiều loài và để phá vỡ ngu trong hạt giống không hoạt động. Trước khi điều trị của hạt giống blueberry với GA4 7 lúc nảy mầm 100-500 mg/l tăng tốc (Ballington, 1984). Arbu-tus andrachne L. (đông dâu cây) hạt điều trị bằng 250 mg/l tên gọi GA3 đã nảy mầm 86% (Karam và Al-Salem, 2001). Nó đã được báo cáo rằng nảy mầm có thể được gây ra bởi Axít gibberellic ở Vac-cinium myrtillus L. (Giba et al., 1993), Vaccinium corymbosum L. (Dweikat và Lyrene, 1988) và Fagus sylvatica (Nicolás và ctv., 1996) hạt. Những kết quả này xác nhận rằng tên gọi GA3 điều trị tăng cường hạt nảy mầm.

có nghĩa là thời gian nảy mầm (MGT) giảm với sự gia tăng thời gian của sự phân tầng và nồng độ của tên gọi GA3 (hình 1a, b), chỉ ra rằng ngu có thể được bị đàn áp bởi ẩm ướt lạnh và ngoại sinh tên gọi GA3 öùng-



cation. MGT liên quan đến cường độ ngu (Jensen và Eriksen, 2001). Các biện pháp của MGT trong nghiên cứu hiện nay được đo bằng thời gian cần thiết để phát hành ngu và khởi xướng radicle tăng trưởng.

điều trị kết hợp với tên gọi GA3 phân tầng có ý nghĩa thống kê ảnh hưởng nảy mầm (hình 2). Hạt giống được điều trị với 250 mg/l tên gọi GA3 mà không có sự phân tầng đã nảy mầm 35%, trong khi hạt giống được điều trị với 250 mg/l tên gọi GA3 100 ngày phân tầng đã nảy mầm 96%. Tăng thời gian phân tầng từ 0 đến 100 ngày tại 250 mg/l tên gọi GA3 kết quả lên đến một sự gia tăng 174% nảy mầm. Một tác động đáng kể tương tác (p < 0,01) của tên gọi GA3 nồng độ và thời gian của sự phân tầng đã được tìm thấy. Hạt giống ngu ở một số loài có thể là do không đủ sự phát triển của phôi thai, hóa chất ức chế, hoặc sự thất bại của phản ứng hóa học mà làm cho thực phẩm dự trữ trong hạt giống có sẵn cho phôi thai đang phát triển (Hilhorst và Karssen, 1992; Karam và Al-Salem, 2001). Sinh lý ngu trong hạt giống là phụ thuộc vào tỷ lệ của các đơn vị abscisic axit (một sự tăng trưởng ức chế