Stacks Steps by Steps(To use in ass

Stacks Steps by Steps
(To use in association with the Stacks manual available at
http://creskolab.uoregon.edu/stacks/manual/)
0- Input, Output and softwares
Input: -File containing the radtags sequences in fastq format (raw_seq.fq)
-File(s) containing the list of barcode sequences of same length (barcode8nt.txt)
-File containing the genome sequence (genome.fa; for ref_map analysis only)
Output: Create a directory, for example “stacks_analysis”, which will contain all future
output directories and files.
Software: Running Stacks can require the use of other programs such as FastQC, mySQL,
Bowtie and Samtools.
1- FastQC: to check sequence quality (optional)
FastQC will allow to visualizing the reads quality and determine the cut off (= length at
which the reads should be trimmed).
1.1- Run FastQC from the Command Line
> /home/bmb/Analysis_Tools/FastQC/fastqc
1.2- Open the raw_seq.fq file within FastQC interface to start the analysis.
>>>> Example with MungBean:
The statistic “Per base sequence content” shows that the base composition (A, T, C
or G) at the different location seems correctly random until position 70.
The statistic “Per base sequence quality” shows that the average quality score across
all bases of the reads starts to decrease after position 40. Within the first 70 bases, the score
stays high (> 28, within the green area) for 90% of the reads (lower whisker).
In consequence, for maximum quality data the sequences should be trimmed at about
70nt (including barcode)
2- Stacks - process_radtags - to clean the raw data (single-end read)
process_radtags will filtered the reads (according to their quality, barcode and restriction
site), regroup reads by barcode (1 file for each), trim barcode and cut the reads to desired
length.
2.1- Create directory “samples” in the directory “stacks_analysis” to output
the sequence files of all samples (parents + progeny)
2.2- Run process_radtags using the Command Line
> cd /path/to/stacks
> process_radtags -f /path/to/raw_seq.fq -o /path/to/stacks_analysis/samples -b
/path/to/barcode8nt.txt -e apeKI -s 20 -t 62 -c -q -r -D
• f — path to the input file if (single-end sequences). Use “-p” if multiple files in one
directory.
• o — path to output the processed files.
• b — path to a file containing barcodes for this run. One file for each barcode length, one run
for each file.
• e — name of the enzyme used to make the radtags library
• s — set the average score limit (Phred's value) within a sliding window which length is
determined by the flag “-w” (default w=0.15, s=10).
• t — truncate final read length to this value (according to FastQC data).
• c — remove any read with an uncalled base (“N”).
• q — discard reads with low quality scores (according to Phred's value).
• r — rescue barcodes and RAD-Tags (correct barcodes and restriction enzyme sites).
• D — capture discarded reads to a file (useful if processing multiple barcode files).
When using multiple lists containing different barcode length, use the reads discarded from
the process_radtags of the first barcode list (raw_seq.fq.discards) to perform the analysis of
the second, and so on. Start process_radtags using the longest barcodes and finish with the
smallest.
Ex: > process_radtags
-f /path/to/raw_seq.fq
-o /path/to/stacks_analysis/samples
-b /path/to/barcode8nt.txt
-e apeKI -s 20 -t 62 -c -q –D
> process_radtags
-f /path/to/stacks_analysis/samples/raw_seq.fq.discards.fq
-o /path/to/stacks_analysis/samples
-b /path/to/barcode6nt.txt
-e apeKI -s 20 -t 62 -c -q –D
>>>> Example using MungBean:
The option “-r” helped to rescue an additional 10% of the total sequences by
allowing correction of mismatches in the barcode.
When using multiple barcode files. Roughly the same sequences are retained when
using the raw seq or the discarded seq as input. This is however less true for smaller
barcodes for which the use of discarded sequence as input seems to improve data specificity
(ex: “GATT” group present 50% less retained sequences when using the discard sequences
as input compare to the raw sequences as input). STACKS efficiently distinguish between
the different barcodes in respect of their length and sequence. However, using the discarded
seq as input present the advantage of being faster (processing) and avoid the presence of
excess sequences in the “Sequences not recorded” group.
To increase reduce incorporating sequencing error, decrease sliding window size (w),
read length (t) or increase average score limit in window (s). in the example the average
score quality is 20 and the window size is [0.15 x t (93)] = 14 nucleotides. This means that if
the average score within a 15nt-length window drops below 99% of probability of being
correct, the read is discarded.
Phred Quality Score Probability of incorrect base call Base call accuracy
10 1 in 10 90%
20 1 in 100 99%
30 1 in 1000 99.9%
3- mySQL database: to visualize data in web interface
A mySQL database as to be created before running denovo_map or ref_map, in order to
collect the data.
3.1- create a mySQL database
> sudo su
> [sudo] password for bmb: # enter “VA903m”
> mysql -p
> Enter password: # enter “root”
> mysql> create database db_name_radtags; #Always use the same suffix “_radtags”
3.2- create a table and field content in the new mySQL database
> mysql> use db_name_radtags;
> mysql> create table batches (
………
………
);
script (in green) is copied from “stacks.sql” file and paste in the terminal window.
> mysql> q or exit
4- Create a catalog of markers with Stacks
Using denovo_map or ref_map, Stacks will generate a catalog of potential alleles and loci
that can be found in the parents and some of the progeny. The program will generate a
series of files: for each sample: sample1.alleles|matches|snps|tags.tsv; and for the whole
population: batch.catalog.alleles|snps|tags.tsv, batch.genotypes.txt, batch.haplotypes.tsv,
batch.markers.tsv. These files can be use as such or be upload into a MySQL database for
easier analysis using the web interface.
4a- Stacks - denovo_map (without genome sequence)
The program will run a series of stacks components (Ustacks > Cstacks > Sstacks >
genotypes > load_radtags.pl > index_radtags.pl > genotypes) in order to generate a
catalog of loci and alleles (SNPs). In absence of genome sequence to align the radtags
sequences, stacks of reads are generated based on their depth of coverage (number of
identical reads) and associated to create loci based on their sequence similarity. Data can
be view through the mySQL web interface or export in tsv or xls format.
4a.1- Create directory “stacks_denovo” in the directory
“stacks_analysis” to output the catalog files generated from the denovo analysis.
4a.2a- Run denovo_map.pl using the Command Line
> cd /usr/local/share/stacks/scripts
> denovo_map.pl -m 3 -M 1 -n 1 -T 15 -B db_name_radtags -b 1 -A F2 -t
-D “Denovo Map”
-o /path/to/stacks_analysis/stacks_denovo
-p /path/to/stacks_analysis/samples/parent1.fq
-p /path/to/stacks_analysis/samples/parent2.fq
-r /path/to/stacks_analysis/samples/progeny1.fq
-r /path/to/stacks_analysis/samples/progeny2.fq
-r /path/to/stacks_analysis/samples/progeny3.fq
…… enter all samples......
• m —minimum number of raw reads needed to create a stack within an individual and
generate indiv_alleles (default value = 3). Describe as the minimum depth of coverage, the
option is essential to define the stringency level. Higher value of m will insure that less
sequencing error will be treated as polymorphism, but will also reduce the total number of
identified markers.
• M — maximum number of mismatches between stacks to form an haplotype within an
individual and build indiv_loci (default value = 2). It can be seen as the number of SNPs
allowed per locus within same individual. Increasing [M] will increase the number of alleles
and heterozygote loci.
• n — maximum number of mismatches between any two haplotypes (loci) within the
population to build catalog-loci (default value = 0). If [n] > 0, the consensus sequence from
each locus will be used to attempt to merge them together across samples. Therefore, if
locus A from parent 1 is homozygous and locus B from parent 2 is also homozygous, but
they are X nucleotides apart, [n] will govern whether they will be merged when building the
catalog. To get more AAxBB markers, increase [n]. Of course as a side effect when [n]
increases, more physically separate loci will be merge erroneously.
• N — specify the number of mismatches allowed when aligning the secondary reads to
primary stacks (default value = M+2). This is the second run of alignment. The mismatches
here will not count as polymorphism but will be simply ignore, so basically it will just
increase the stack depth. Note that this rescue of reads can have the negative effect by
creating a variation in the locus and the incertitude on whether the locus is homozygous or
heterozygous.
• T — number of threads or cores to run Stacks on.
• t — remove, or break up, highly repetitive RAD-Tags.
• B — name of the mySQL database to load data into.
• b — batch ID representing this dataset (must be a number). Stacks can be run multiple times
on the same dataset and the results will be added to the same database by specifying
different batch IDs. If using an already existing batch ID, the data will not erase the
precious data present in this batch but will be added to them).
• D — batch description.
• H — disable mapping of secondary reads.
• A — if processing a genetic map, specify the cross type, 'CP' (Cross Pollinated = F1 cross),
'F2' (F2 cross, with F0 submitted as the parents), 'BC1' (backcross F1x Parent), 'DH'
(Doubled Haploids), or 'GEN' (Generic, to get a list of all possible markers independently of
the cross type). The program will throw out alleles that could not occur in the specified cross
type situation (Ex.1: in a F2 cross we can have AA/BB markers fr

Kết quả (Việt) 1:

Xếp chồng các bước của bước(Để sử dụng cùng với hướng dẫn sử dụng ngăn xếp có sẵn tạihttp://creskolab.uoregon.edu/Stacks/Manual/)0-đầu vào, đầu ra và phần mềmĐóng góp:-tập tin có chứa các chuỗi radtags ở định dạng fastq (raw_seq.fq)-Tệp chứa danh sách các trình tự mã vạch của cùng một chiều dài (barcode8nt.txt)-Các tập tin có chứa chuỗi bộ gen (genome.fa; ref_map phân tích chỉ)Đầu ra: Tạo ra một thư mục, ví dụ: "stacks_analysis", mà sẽ bao gồm tất cả trong tương laiđầu ra thư mục và tập tin.Phần mềm: Ngăn xếp chạy có thể yêu cầu việc sử dụng các chương trình khác chẳng hạn như FastQC, mySQL,Bowtie và Samtools.1 - FastQC: để kiểm tra chất lượng trình tự (tùy chọn)FastQC sẽ cho phép để hình dung chất lượng lần đọc và xác định việc cắt giảm tắt (= chiều dài tạimà lần đọc các nên được trimmed).1.1 quản FastQC từ dòng lệnh> /home/bmb/Analysis_Tools/FastQC/fastqc1.2 - mở tập tin raw_seq.fq trong FastQC giao diện để bắt đầu phân tích.>>>> Ví dụ với MungBean:Số liệu thống kê "một nội dung cơ sở chuỗi" cho thấy rằng các thành phần cơ bản (A, T, Choặc G) tại điểm khác nhau có vẻ ngẫu nhiên một cách chính xác cho đến vị trí 70.Số liệu thống kê "mỗi chuỗi cơ sở chất lượng" cho thấy rằng số điểm chất lượng trung bình trênTất cả các căn cứ của các lần đọc bắt đầu giảm sau khi vị trí 40. Trong các căn cứ đầu tiên 70, số điểmở lại cao (> 28, trong khu vực màu xanh lá cây) 90% của lần đọc (thấp hơn thác).Trong đó, cho dữ liệu chất lượng tối đa các chuỗi nên được tỉa lúc về70nt (bao gồm cả mã vạch)2 - ngăn xếp - process_radtags - để làm sạch các dữ liệu thô (đọc đơn-kết thúc)process_radtags sẽ lọc lần đọc (theo chất lượng, mã vạch và hạn chế của họTrang web), tập hợp lần đọc bởi mã vạch (1 tập tin cho mỗi), mã vạch cắt và cắt lần đọc để mong muốnchiều dài.2.1 - tạo thư mục "mẫu" trong thư mục "stacks_analysis" để đầu racác tập tin trình tự của tất cả mẫu (cha mẹ + con cháu)2.2 do process_radtags bằng cách sử dụng dòng lệnh> cd /path/to/stacks> process_radtags -f /path/to/raw_seq.fq -o /path/to/stacks_analysis/samples -b/Path/to/barcode8nt.txt -e apeKI -s 20 -t 62 - c - q - r -D• f-đường dẫn đến tập tin đầu vào nếu (single-end đoạn). Sử dụng "-p" nếu nhiều tập tin trong mộtthư mục.• o-đường dẫn đến sản lượng các tập tin xử lý.• b-đường dẫn đến một tập tin có chứa các mã vạch cho dài này. Một tập tin cho mỗi chiều dài mã vạch, một chạycho mỗi file.• e-tên enzyme được sử dụng để làm cho thư viện radtags• s-tập trung bình điểm giới hạn (của Phred giá trị) trong vòng một cửa sổ trượt chiều dài mà làxác định bằng các cờ "-w" (mặc định w = 0,15, s = 10).• t-truncate cuối cùng đọc các chiều dài để giá trị này (theo dữ liệu FastQC).• c-loại bỏ bất kỳ đọc với một cơ sở chưa bôi ("N").• q-loại bỏ các lần đọc có chất lượng thấp điểm (theo giá trị của Phred).• r-cứu mã vạch và RAD-Tags (chính xác mã vạch và hạn chế enzyme trang web).• D — nắm bắt các lần đọc bị loại bỏ vào một tập tin (hữu ích nếu xử lý nhiều file mã vạch).Khi sử dụng nhiều danh sách có chứa chiều dài của mã vạch khác nhau, sử dụng đọc bị loại bỏ từprocess_radtags danh sách mã vạch đầu tiên (raw_seq.fq.discards) để thực hiện phân tích củaThứ hai, và như vậy. Bắt đầu process_radtags bằng cách sử dụng mã vạch dài nhất và kết thúc với cácnhỏ nhất.Ví dụ: > process_radtags được viết bởi admin-f /path/to/raw_seq.fq được viết bởi admin-o /path/to/stacks_analysis/samples được viết bởi admin/path/to/barcode8nt.txt -b được viết bởi admin-e apeKI -s 20 -t 62 - c - q-D> process_radtags được viết bởi admin-f /path/to/stacks_analysis/samples/raw_seq.fq.discards.fq được viết bởi admin-o /path/to/stacks_analysis/samples được viết bởi admin/path/to/barcode6nt.txt -b được viết bởi admin-e apeKI -s 20 -t 62 - c - q-D>>>> Ví dụ bằng cách sử dụng MungBean:Tùy chọn "-r" đã giúp để giải cứu một thêm 10% của các chuỗi tất cả bởicho phép các chỉnh sửa của mismatches trong mã vạch.Khi sử dụng nhiều mã vạch tập tin. Khoảng cùng một chuỗi được giữ lại khisử dụng nguyên seq hoặc seq bị loại bỏ như là đầu vào. Điều này tuy nhiên ít đúng cho nhỏ hơnmã vạch mà việc sử dụng các loại bỏ trình tự như đầu vào có vẻ để cải thiện dữ liệu đặc trưng(ví dụ: "GATT" nhóm hiện tại 50% ít giữ lại trình tự khi sử dụng trình tự huỷnhư là đầu vào so sánh với các chuỗi nguyên như đầu vào). Ngăn xếp hiệu quả phân biệt giữamã vạch khác nhau đối với chiều dài và trình tự của họ. Tuy nhiên, sử dụng các bị loại bỏseq như đầu vào trình bày lợi thế là nhanh hơn (xử lý) và tránh sự hiện diện củaquá trình tự trong nhóm "Chuỗi không ghi lại".Để tăng giảm hợp trình tự lỗi, giảm kích thước cửa sổ trượt (w),đọc chiều dài (t) hoặc tăng là điểm giới hạn trong cửa sổ (s). trong ví dụ trung bìnhđiểm chất lượng là 20 và kích thước cửa sổ là [0,15 x t (93)] = 14 nucleotide. Điều này có nghĩa là nếuđiểm trung bình trong một cửa sổ 15nt dài giảm xuống dưới 99% của các xác suất đượcchính xác, đọc được bỏ đi.Phred chất lượng được điểm xác suất không chính xác cơ sở gọi căn cứ gọi chính xác10 1 trong 10 90%20 1 trong 100 99%30 1 trong 1000 99,9%3 - mySQL cơ sở dữ liệu: để hình dung dữ liệu trong giao diện webCơ sở dữ liệu mySQL như được tạo trước khi chạy denovo_map hoặc ref_map, đểthu thập dữ liệu.3.1 - tạo một cơ sở dữ liệu mySQL> sudo su> [sudo] mật khẩu cho bmb: # nhập "VA903m"> mysql -p> Nhập mật khẩu: # nhập "gốc"> mysql > tạo cơ sở dữ liệu db_name_radtags; #Always sử dụng cùng một hậu tố "_radtags"3.2 - tạo một nội dung bảng và lĩnh vực trong cơ sở dữ liệu mySQL mới> mysql > sử dụng db_name_radtags;> mysql > tạo bảng lô ()………………);kịch bản (trong màu xanh lá cây) được sao chép từ tập tin "stacks.sql" và dán trong cửa sổ thiết bị đầu cuối.> mysql > q hoặc thoát4 - tạo một danh mục của các dấu hiệu với ngăn xếpBằng cách sử dụng denovo_map hoặc ref_map, ngăn xếp sẽ tạo ra một cửa hàng của tiềm năng alen và locimà có thể được tìm thấy ở các bậc cha mẹ và một số các con cháu. Chương trình sẽ tạo ra mộtloạt các tập tin: cho mỗi mẫu: sample1.alleles|matches|snps|tags.tsv; và cho toàn bộdân số: batch.catalog.alleles|snps|tags.tsv, batch.genotypes.txt, batch.haplotypes.tsv,Batch.Markers.tsv. những tập tin này có thể là sử dụng như vậy hoặc là tải lên thành một cơ sở dữ liệu MySQL chodễ dàng hơn phân tích bằng cách sử dụng giao diện web.4A-ngăn xếp - denovo_map (không có trình tự bộ gen)Chương trình sẽ chạy một loạt các thành phần ngăn xếp (Ustacks > Cstacks > Sstacks >kiểu gen > load_radtags.pl > index_radtags.pl > kiểu gen) để tạo ra mộtdanh mục của loci và alen (SNPs). Trong sự vắng mặt của chuỗi bộ gen để sắp xếp các radtagstrình tự, ngăn xếp của lần đọc được tạo ra dựa trên của chiều sâu của bảo hiểm (sốlần đọc giống hệt nhau) và kết hợp để tạo ra loci dựa trên của chuỗi tương tự. Dữ liệu có thểlà xem thông qua giao diện web mySQL hoặc xuất khẩu ở định dạng tsv hoặc xls.4A.1-tạo thư mục "stacks_denovo" trong thư mục"stacks_analysis" để đầu ra tệp catalô được tạo ra từ phân tích denovo.denovo_map.pl 4A.2A-chạy bằng cách sử dụng dòng lệnh> cd /usr/local/share/stacks/scripts> denovo_map.pl -m 3 - M 1 - n 1 -T 15 -B db_name_radtags -b 1 -A F2 -t được viết bởi admin-D "Denovo bản đồ" được viết bởi admin-o /path/to/stacks_analysis/stacks_denovo được viết bởi admin-p /path/to/stacks_analysis/samples/parent1.fq được viết bởi admin-p /path/to/stacks_analysis/samples/parent2.fq được viết bởi admin-r /path/to/stacks_analysis/samples/progeny1.fq được viết bởi admin-r /path/to/stacks_analysis/samples/progeny2.fq được viết bởi admin-r /path/to/stacks_analysis/samples/progeny3.fq được viết bởi admin... nhập tất cả mẫu...• m — tối thiểu số lần đọc nguyên cần thiết để tạo ra một ngăn xếp trong vòng một cá nhân vàtạo ra indiv_alleles (mặc định giá trị = 3). Mô tả như là độ sâu tối thiểu bảo hiểm, cáctùy chọn là cần thiết để xác định mức độ stringency. Các giá trị cao hơn của m sẽ bảo đảm rằng íttrình tự lỗi sẽ bị coi là đa hình, nhưng cũng sẽ làm giảm tổng sốđánh dấu được xác định.• M-số lượng tối đa của mismatches giữa các ngăn xếp để tạo thành một haplotype trong vòng mộtcá nhân và xây dựng indiv_loci (mặc định giá trị = 2). Nó có thể được xem như là số lượng SNPscho phép một locus trong cùng một cá nhân. Việc tăng [M] sẽ tăng số lượng alenvà heterozygote loci.• n-số lượng tối đa của mismatches giữa bất kỳ hai haplotypes (loci) trong cácdân để xây dựng danh mục-loci (mặc định giá trị = 0). Nếu [n] > 0, sự đồng thuận chuỗi từQuỹ tích mỗi sẽ được sử dụng để cố gắng hợp nhất chúng lại với nhau trên mẫu. Vì vậy, nếulocus A từ cha mẹ 1 là màu và locus B từ cha mẹ 2 cũng là màu, nhưnghọ là X nucleotide ngoài, [n] sẽ quản cho dù họ sẽ được hợp nhất khi xây dựng cácdanh mục. Để có được thêm AAxBB đánh dấu, tăng [n]. Tất nhiên như là một bên có hiệu lực khi [n]tăng, nhiều hơn về thể chất riêng biệt loci sẽ sáp nhập sai lầm.• N-chỉ định số mismatches được cho phép khi việc xếp thẳng lần đọc thứ cấp đểngăn xếp chính (mặc định giá trị = M + 2). Điều này là chạy thứ hai của liên kết. Các mismatchesở đây sẽ không tính là đa hình nhưng sẽ được chỉ đơn giản là bỏ qua, vì vậy, về cơ bản nó sẽ chỉtăng độ sâu ngăn xếp. Lưu ý rằng giải cứu này lần đọc có thể có tác động tiêu cực bởitạo ra một biến thể trong locus và incertitude vào locus là màu hoặchổ.• T-số của chủ đề hoặc lõi để chạy ngăn xếp trên.• t-loại bỏ hoặc chia tay, lặp đi lặp lại rất RAD-Tags.• B-tên của cơ sở dữ liệu mySQL để tải dữ liệu vào.• b-batch ID đại diện cho số liệu này (phải là một số). Ngăn xếp có thể được chạy nhiều lầntrên cùng một bộ dữ liệu và kết quả sẽ được thêm vào cơ sở dữ liệu tương tự bằng cách xác địnhkhác nhau lô ID. Nếu sử dụng một đã tồn tại hàng loạt ID, dữ liệu sẽ không xóa cácquý giá dữ liệu trình bày trong lô này nhưng sẽ được thêm vào chúng).• D — hàng loạt các mô tả.• H — vô hiệu hoá bản đồ của lần đọc thứ cấp.• Một — nếu xử lý bản đồ di truyền, chỉ định các loại chéo, 'CP' (qua Pollinated = F1 chéo),'F2' (F2 chéo, với F0 gửi như là cha mẹ), 'BC1' (backcross F1x cha mẹ), 'DH'(Tăng gấp đôi Haploids), hoặc 'GEN' (chung, để có được một danh sách tất cả có thể đánh dấu independently củaloại chéo). Chương trình sẽ ném ra alen có thể không xảy ra trong các quy định vượt qualoại tình huống (Ex.1: trong một F2 qua, chúng tôi có thể có AA/BB đánh dấu fr

Kết quả (Việt) 2:

Stacks Steps bằng bước
(Để sử dụng kết hợp với hướng dẫn Stacks sẵn tại
http://creskolab.uoregon.edu/stacks/manual/)
0- Input, Output và phần mềm
Input: -File chứa các trình tự radtags ở định dạng fastq (raw_seq .fq)
-File (s) có chứa danh sách các chuỗi mã vạch của cùng một chiều dài (barcode8nt.txt)
-File chứa trình tự bộ gen (genome.fa; để phân tích ref_map chỉ)
Output: Tạo một thư mục, ví dụ như "stacks_analysis", trong đó sẽ chứa tất cả tương lai
thư mục đầu ra và các tập tin.
Phần mềm: Chạy Stacks có thể yêu cầu sử dụng của các chương trình khác như FastQC, mySQL,
. Bowtie và Samtools
1- FastQC: để kiểm tra chất lượng trình tự (tùy chọn)
FastQC sẽ cho phép hình dung chất lượng lần đọc và xác định cắt đứt (= chiều dài tại
đó đọc nên được tỉa).
1.1- Run FastQC từ Command Line
> / home / BMB / Analysis_Tools / FastQC / fastqc
1.2- mở các tập tin trong giao diện raw_seq.fq FastQC để bắt đầu phân tích.
>>>> Ví dụ với đậu xanh:
Các số liệu thống kê "mỗi nội dung trình tự base" cho thấy rằng các thành phần cơ bản (A, T, C
hoặc G) tại các vị trí khác nhau có vẻ chính xác ngẫu nhiên cho đến vị trí 70.
Các số liệu thống kê "chất lượng mỗi chuỗi cơ sở "cho thấy rằng các điểm chất lượng trung bình của
tất cả các căn cứ của các lần đọc bắt đầu giảm sau khi vị trí 40. Trong 70 cơ sở đầu tiên, điểm số
vẫn ở mức cao (> 28, trong khu vực màu xanh lá cây) cho 90% số lần đọc (râu ria thấp hơn).
Trong hậu quả, cho chất lượng dữ liệu tối đa các trình tự nên được cắt vào khoảng
70nt (bao gồm cả mã vạch)
2- Stacks - process_radtags - để làm sạch các dữ liệu thô (single-end đọc)
process_radtags sẽ lọc các lần đọc (tùy theo chất lượng, mã vạch và hạn chế của họ
chỗ), tập hợp lại đọc bằng mã vạch (1 file cho mỗi), cắt mã vạch và cắt lần đọc với mong muốn
chiều dài.
2.1- Tạo thư mục "mẫu" trong thư mục "stacks_analysis" để ra
các tập tin trình tự của tất cả các mẫu (cha mẹ + con cháu)
2.2- process_radtags Run bằng cách sử dụng Command Line
> cd / path / to / ngăn xếp
> process_radtags -f /path/to/raw_seq.fq -o / path / to / stacks_analysis / mẫu -b
/path/to/barcode8nt.txt -e apeKI -s -t 20 -c 62 -q -R -D
• f - đường dẫn đến tập tin đầu vào if (chuỗi single-end). Sử dụng "-p" nếu nhiều file trong một
thư mục.
• o - đường dẫn đến sản lượng các tập tin xử lý.
• b - đường dẫn đến một tập tin có chứa mã vạch cho lần chạy này. Một tập tin cho mỗi chiều dài mã vạch, một chạy
cho mỗi tập tin.
• e - tên của enzyme được sử dụng để làm cho thư viện radtags các
• s - thiết lập giới hạn số điểm trung bình (giá trị PHRED của) trong một cửa sổ trượt mà chiều dài được
xác định bằng các lá cờ " -w "(mặc định w = 0,15, s = 10).
• t - cắt ngắn chiều dài đọc cuối cùng để giá trị này (theo số liệu FastQC).
• c - loại bỏ bất kỳ chi với một cơ sở chưa bôi ("N").
• q - discard đọc với điểm chất lượng thấp (theo giá trị PHRED của).
• r - mã vạch cứu và RAD-Tags (mã vạch chính xác và các trang web enzyme giới hạn).
• D - chụp phế đọc vào một tập tin (hữu dụng nếu chế biến nhiều file mã vạch).
Khi sử dụng nhiều danh sách có chứa độ dài mã vạch khác nhau, sử dụng các lần đọc bỏ đi từ
các process_radtags của danh sách mã vạch đầu tiên (raw_seq.fq.discards) để thực hiện việc phân tích
thứ hai, và như vậy. Bắt đầu bằng cách sử dụng mã vạch process_radtags dài nhất và kết thúc với
nhỏ nhất.
Ex:> process_radtags
-f /path/to/raw_seq.fq
o / path / to / stacks_analysis / samples
-b /path/to/barcode8nt.txt
-e apeKI -s -t 20 -c 62 -q -D
> process_radtags
-f /path/to/stacks_analysis/samples/raw_seq.fq.discards.fq
o / path / to / stacks_analysis / samples
-b /path/to/barcode6nt.txt
-e apeKI -s -t 62 -c 20 -q -D
>>>> Ví dụ sử dụng đậu xanh:
Các tùy chọn "-r" đã giúp giải cứu thêm 10% tổng số các trình tự do
cho phép điều chỉnh các sai lệch trong mã vạch.
Khi sử dụng nhiều file mã vạch. Khoảng trình tự cùng được giữ lại khi
sử dụng seq seq liệu hoặc loại bỏ như đầu vào. Tuy nhiên điều này là ít sự thật cho nhỏ hơn
mã vạch mà việc sử dụng các trình tự bị loại bỏ như là đầu vào dường như cải thiện độ đặc hiệu dữ liệu
(ví dụ: "GATT" nhóm hiện nay 50% ít giữ lại trình tự khi sử dụng các trình tự loại bỏ
như là đầu vào so sánh với các trình tự nguyên như đầu vào) . Stacks hiệu quả phân biệt giữa
các loại mã vạch khác nhau trong sự tôn trọng của chiều dài và trình tự của họ. Tuy nhiên, bằng cách sử dụng các phế
seq như đầu vào trình bày các lợi thế là nhanh hơn (chế biến) và tránh sự hiện diện của
chuỗi dư thừa trong "Sequences không ghi" nhóm.
Để tăng giảm kết hợp lỗi trình tự, giảm kích thước cửa sổ trượt (w),
đọc dài (t) hoặc tăng giới hạn số điểm trung bình trong cửa sổ (s). trong ví dụ trung bình
điểm chất lượng là 20 và kích thước cửa sổ là [0.15 xt (93)] = 14 nucleotide. Điều này có nghĩa rằng nếu
điểm trung bình trong một cửa sổ 15nt dài giảm xuống dưới 99% xác suất là
đúng, đọc được loại bỏ.
Điểm PHRED chất lượng Xác suất của cơ sở cuộc gọi không chính xác chính xác cuộc gọi cơ sở
10 1 10 90%
20 1 100 99 %
30 1 vào năm 1000 99,9%
cơ sở dữ liệu mySQL 3: để hiển thị dữ liệu trong giao diện web
Một cơ sở dữ liệu mySQL như được tạo ra trước khi chạy denovo_map hoặc ref_map, để
. thu thập các dữ liệu
3.1- tạo ra một cơ sở dữ liệu mySQL
> sudo su
> [sudo ] password cho BMB: # nhập "VA903m"
> mysql-p
> Nhập mật khẩu: # nhập "root"
> mysql> tạo db_name_radtags cơ sở dữ liệu; #Always Sử dụng hậu tố "cùng một _radtags"
3.2- tạo một bàn và lĩnh vực nội dung trong cơ sở dữ liệu mySQL mới
> mysql> db_name_radtags sử dụng;
> mysql> tạo một bó bảng (
.........
.........
);
kịch bản (màu xanh) được sao chép từ "stacks.sql" tập tin và dán vào cửa sổ terminal.
> mysql> q cảnh
4- Tạo một danh mục các mốc với Stacks
Sử dụng denovo_map hoặc ref_map, Stacks sẽ tạo ra một danh mục các alen tiềm năng và loci
có thể được tìm thấy trong các bậc phụ huynh và một số các thế hệ con cháu. Chương trình sẽ tạo ra một
loạt các tập tin: cho mỗi mẫu: sample1.alleles | phù hợp | SNPs | tags.tsv; và đối với toàn
dân: batch.catalog.alleles | SNPs | tags.tsv, batch.genotypes.txt, batch.haplotypes.tsv,
batch.markers.tsv. Những tập tin này có thể được sử dụng như thế hoặc được tải lên vào một cơ sở dữ liệu MySQL để
phân tích dễ dàng hơn bằng cách sử dụng giao diện web.
4a- Stacks - denovo_map (không có trình tự bộ gen)
Chương trình sẽ chạy một loạt các thành phần ngăn xếp (Ustacks> Cstacks> Sstacks>
kiểu gen> load_radtags.pl> index_radtags.pl> kiểu gen) để tạo ra một
danh mục các loci và alen (SNPs). Trong trường hợp không có trình tự bộ gen để sắp xếp các radtags
trình tự, ngăn xếp của lần đọc được được tạo ra dựa trên độ sâu của họ về bảo hiểm (số
giống hệt nhau lần đọc) và kết hợp để tạo ra loci dựa trên sự giống trình tự của họ. Dữ liệu có thể
được xem thông qua giao diện web mySQL hoặc xuất khẩu ở định dạng tsv hoặc xls.
4a.1- Tạo thư mục "stacks_denovo" trong thư mục
"stacks_analysis" để sản xuất các tệp danh mục được tạo ra từ các denovo phân tích.
4a.2a- Run denovo_map. pl bằng cách sử dụng Command Line
> cd / usr / local / share / stacks / script
> denovo_map.pl -m 3 -M 1 -n 1 -T 15 -B db_name_radtags -b 1 -A F2 -t
-D "Denovo Bản đồ "
o / path / to / stacks_analysis / stacks_denovo
p /path/to/stacks_analysis/samples/parent1.fq
p /path/to/stacks_analysis/samples/parent2.fq
r / path / to / stacks_analysis / mẫu / progeny1.fq
r /path/to/stacks_analysis/samples/progeny2.fq
r /path/to/stacks_analysis/samples/progeny3.fq
...... nhập tất cả các mẫu ......
• m số -minimum của nguyên lần đọc cần thiết để tạo ra một ngăn xếp trong một cá nhân và
tạo ra indiv_alleles (giá trị mặc ​​định = 3). Mô tả như là độ sâu tối thiểu vùng phủ sóng, các
tùy chọn là rất cần thiết để xác định mức độ nghiêm ngặt. Giá trị cao hơn của m sẽ đảm bảo rằng ít
lỗi lập trình tự sẽ được đối xử như đa hình, nhưng cũng sẽ làm giảm tổng số
các dấu hiệu xác định.
• M - số lượng tối đa của sự không phù hợp giữa ngăn xếp để tạo thành một haplotype trong vòng một
cá nhân và xây dựng indiv_loci (giá trị mặc ​​định = 2). Nó có thể được xem như là số lượng SNPs
cho phép mỗi locus trong cùng một cá nhân. Tăng [M] sẽ tăng số lượng các alen
và dị hợp tử loci.
• n - số lượng tối đa của sự không phù hợp giữa bất kỳ hai haplotype (loci) trong
dân để xây dựng Danh mục-loci (giá trị mặc ​​định = 0). Nếu [n]> 0 thì chuỗi sự đồng thuận từ
mỗi vị trí sẽ được sử dụng để cố gắng để kết hợp chúng lại với nhau tất cả các mẫu. Vì vậy, nếu
locus A từ mẹ 1 là đồng hợp tử và locus B từ mẹ 2 cũng là đồng hợp tử, nhưng
họ là X nucleotide ngoài, [n] sẽ chi phối việc họ sẽ được sáp nhập khi xây dựng các
danh mục. Để có được dấu AAxBB hơn, tăng [n]. Tất nhiên là một tác dụng phụ khi [n]
để tăng, thể chất nhiều hơn loci riêng biệt sẽ được hợp nhất sai lầm.
• N - xác định số sai lệch cho phép khi việc sắp xếp các thứ đọc để
ngăn xếp chính (giá trị mặc ​​định = M + 2). Đây là chạy thứ hai của liên kết. Các sai lệch
ở đây sẽ không được tính là đa hình nhưng sẽ chỉ đơn giản là bỏ qua, vì vậy về cơ bản nó chỉ sẽ
tăng stack sâu. Lưu ý rằng giải cứu này lần đọc có thể có tác động tiêu cực của
việc tạo ra một sự thay đổi trong các locus và không quả quyết về việc liệu các locus là đồng hợp tử hay
dị hợp tử.
• T - số chủ đề hoặc lõi để chạy Stacks trên.
• t - loại bỏ, hoặc nghỉ lên, lặp lại cao RAD-Tags.
• B -. tên của cơ sở dữ liệu mySQL để tải dữ liệu vào
• b - ID batch đại diện cho tập dữ liệu này (phải là một số). Stacks có thể chạy nhiều lần
trên cùng một tập dữ liệu và kết quả sẽ được bổ sung vào cơ sở dữ liệu tương tự bằng cách xác định
các ID hàng loạt khác nhau. Nếu sử dụng một ID batch đã tồn tại, dữ liệu sẽ không xóa các
dữ liệu quý hiện trong đợt này nhưng sẽ được thêm vào cho họ).
• D - mô tả hàng loạt.
• H - vô hiệu hóa bản đồ của phụ đọc.
• A - nếu chế biến một gen bản đồ, xác định kiểu chéo, là CP (Cross thụ phấn chéo = F1),
"F2" (F2 chéo, với F0 trình như cha mẹ), 'BC1' (hồi giao F1x Parent), "DH"
(Tăng gấp đôi Haploids), hoặc 'GEN' (Generic, để có được một danh sách của tất cả các dấu hiệu có thể độc lập với
các loại diện). Chương trình sẽ ném ra alen mà không thể xảy ra trong các quy định cross
tình kiểu (Ex.1: ngang F2 chúng ta có thể có AA / BB dấu fr