In vitro Rapid clonal propagation o

In vitro Rapid clonal propagation of Phyllanthus urinaria Linn. (Euphorbiaceae) – A Medicinal
Plant

Kalidass C*, and Mohan V.R
Ethnopharmacology unit, Research Department of Botany,
V.O.Chidambaram College, Tutuicorin-8.
*Corresponding author e-mail: [e-mail]

Abstract: An efficient micropropagation protocol was developed for the medicinal plant Phyllanthus urinaria Linn. (Euphorbiaceae) using nodal segments for axillary shoot proliferation. Maximum multiplication rates was achieved on Ms Media supplemented with 1.0 µM BA. Rooting was achieved with 100% of the micro shoots in MS medium with 2.0 µM IBA. Regenerated plants were successfully acclimatized and about 80 – 90 % of plantlets survived under ex vitro conditions. [Researcher. 2009;1(4):56-61]. (ISSN: 1553-9865).

Key words: Phyllanthus urinaria Linn., Euphorbiaceae, Clonal propagation, acclimatization.

Introduction
The genus Phyllanthus Linn. (Euphorbiaceae) has between 550 to 750 species and several of them produce useful secondary metabolites which have been extracted from whole plants (Unander 1996). The stems, infusion of leaves and roots of Phyllanthus spp are used in folk medicine for treating intestinal infections, diabetes, the hepatitis B virus and disturbances of the kidney and urinary bladder (Calixto et al., 1998). Several compounds such as alkaloids, tannins, flavonoids, lignans, phenols and terpenes have been isolated and identified in various species of Phyllanthus and have shown antinociceptive action in mice and other therapeutic activities (Cechinel Filho et al., 1996). Antiviral effects against hepatitis B virus and possibly against the reverse transcriptase of retroviruses have also been reported (Venkateswaran et al., 1987, Thyagarajan et al., 1988, Shead et al., 1992). Pharmacological studies carried out with callus extracts of P. niruri, P. tenellus and P. urinaria have shown antinociceptive properties and the main compounds identified in the extracts were flavonoids, tannins and phenols (Santos et al., 1994). Additional studies on callus and root extracts of these different species have shown the presence of phyllemblin, a tannin which has antimicrobial activity, of possible hydrolyzable tannins which inhibited DNA polymerase and reverse transcriptase, of geraniin and its derivatives which showed high activity in the inhibitions of HIV reverse transcriptase and angiotensin-converting enzyme involved in diabetic complications (Ueno et al., 1988, Ogata et al., 1992, Unander 1996).
The gallotannin corilagin, the haemostatic ellagic acid, as well as seven ellagitannins, which have been shown to be active against Epstein–Barr virus DNA polymerase at the micro-molar level (Liu et al., 1999), have been isolated from Phyllanthus urinaria Linn. Two new phenolic compounds, namely methyl brevifolin carboxylate and trimethyl ester dihydrochebulic acid, have also been isolated from the same source (Yao and Zuo, 1993). Corilagin has been reported to show bioactivity in various different therapeutic areas such as cardiovascular disease anti-hypertensive (Lin et al., 1993; Cheng et al., 1995) and infectious disease antiviral (Yoon et al., 2000). Therefore, the aim of the current work was to establish consistent micropropagation, for P. urinaria Linn. for large scale multiplication of selected genotypes and to explore their potential for secondary metabolite studies.

Materials and Methods
Tender twigs were collected from field grown mature plants of P. urinaria L. defoliated and sectioned into 2 - 3 nodal segments. They were washed under continuous flashing of running tap water for 30 min and then treated with a solution of the Savlon (5% v/v) for 10 min and finally surface sterilized with HgCl2 (0.1% w/v) for 5-10 min. Lastly, the material was washed 3 -5 times with autoclaved distilled water to remove any trace of HgCl2.
The shoot tip and nodal segments were excised from the disinfected material and divided into 1.0 - 1.5 cm pieces with at least one node in each explants. The basal medium used for all the experiments was MS (Murashige and Skoog 1962) formulation containing 3% sucrose, 6 - 8 % agar and supplemented with BA and KN, either individually or in different combinations with auxins, IBA, NAA and IAA. The media were adjusted to pH 5.7 ± 0.2 and autoclaved at 1.1 kg/cm2 for 20 min at 121°C.
Cultures were incubated at 25 ± 1°C with a photoperiod of 16 h at 2000 - 3000 lux of cool white fluorescent light. Cultures were initiated in 150 - 25 mm glass tube and subcultured regularly on fresh medium at four-week intervals in 100 ml flasks. The shoots that proliferated from primary explants were isolated and subcultured on fresh medium several times for bulking up shoot culture material. Shoots (3 - 4 cm) were excised from proliferating cultures and implanted on half strength MS supplemented with either of IBA, NAA and IAA (0.1 - 1.0 µM) for rooting. Rooted shoots were transferred to pots under ex vitro condition after proper hardening.

Results and Discussion
Axillary shoot induction, multiplication and rooting, the effects of cytokinins and auxins on morphogenesis of nodal segment explants are presented in Tables 1, and 2. The effects of cytokinins and auxins at various concentrations on axillary shoot induction from nodal explants are presented in Tables 1. Cytokinins did not promote intensive shoot multiplication and either had no effect or inhibited significantly the number of nodes, shoot length and culture fresh mass in comparison to the controls (Table 1). The proliferation efficiency of nodal explants from mature plants was significantly higher than that of shoot tip explants when evaluated twenty days after proliferation. As a supplement, 1.0 µM BA showed the best performance of proliferation that produced shoots in 100% of cultured explants. Explants produced the highest number of 2.85 ± 0.10 shoots per culture on the medium with 5.97 ± 0.13 cm average length of shoots per culture (Figs. B - D). When the explants were cultured on KN based medium, only 47 - 73% of them proliferated. In this treatment, the highest number of shoots per explants and average shoot lengths were 5.23 ± 0.24 and 4.60 ± 0.35 cm for nodal explants, respectively.
These are the first attempts to establish shoot cultures of this species and the results obtained show that the unusual promotive effects of IBA on shoot culture growth was not only due to the increase in axillary shoot proliferation but also in the number of axillary buds formed in the shoots which can be used as starting plant material for further multiplication. Similar results were obtained for Leptadenia reticulata shoot cultures, where IBA, NAA and IAA stimulated significantly the number of nodes per plantlet in comparison to cytokinins (Kalidass et al., 2008).However, for other Phyllanthus species, such as P. tenellus, P. niruri, P. caroliniensis, and P. fraternus (Catapan 1999, Saradhi and Islamia 1997) and for other Euphorbiaceae species, such as Excoecaria agallocha L. (Rao et al., 1998) cytokinins stimulated shoot proliferation.
Root formation was induced in in vitro regenerated shoots by culturing them on half strength of MS with 0.1 - 4.0 µM either of IBA, NAA, and IAA. Among the three types of auxin, IBA was found to be most effective at different concentrations tested for root production on cut margins of the shoot (Table 2). Among different concentrations, 2.0 µM IBA was found to be the best for proper rooting in which 100% shoots rooted within three weeks of culture (Fig. D). These findings are in agreement with those observed in other plant species Phyla nodfolia, Leptadenia reticulata (Bhatt et al., 2006) and Lins culinaris Medik (Omran et al., 2008). The in vitro derived plants acclimated better under ex vitro condition when they were transferred on specially made plastic trays containing coco-peat as potting mix and moistened uniformly at periodic intervals taking special care not to damage the roots. The rest of the procedure, followed from this stage up to their establishment in soil was as usual.
About 80 - 90% of the regenerated plantlets could tolerate and survive under ex vitro environment or field conditions. A number of plantlets were lost due to damping off and necrosis during acclimatization in ex vitro condition. Loss of regenerants due to such symptoms was also observed in Eucalyptus tereticornis (Gill et al., 1993), Solanum nigrum (Ara et al., 1993), Rauvolfia serpentina (Ilahi 1993) and Rosa damascena (Kumar et al., 1995). Through this study a protocol for regeneration of complete plantlets has been established. This is perhaps the first report on in vitro plant regeneration of Phyllanthus urinaria Linn. The results may be of some importance as a pioneering study on tissue culture of this medicinal plant.

Kết quả (Việt) 1:

Trong ống nghiệm tuyên truyền nhanh chóng vô tính của Phyllanthus urinaria Linn. (Họ Euphorbiaceae) – một thuốc Thực vật Kalidass C *, và Mohan V.R Đơn vị Ethnopharmacology, nghiên cứu vùng of Botany, V.O.Chidambaram College, Tutuicorin-8. * Tương ứng tác giả thư điện tử: [e-mail] Tóm tắt: Một giao thức hiệu quả micropropagation được phát triển cho y học thực vật Phyllanthus urinaria Linn. (Họ Euphorbiaceae) bằng cách sử dụng nút phân đoạn cho nách lá bắn phổ biến vũ khí. Tỷ lệ tối đa nhân đã đạt được trên Ms phương tiện bổ sung với 1.0 μm BA. Rễ đã được thực hiện với 100% của các cành nhỏ trong MS trung bình với 2.0 μm IBA. Nhà máy tái tạo thành công đã được di thực và khoảng 80-90% plantlets sống sót dưới cũ ống nghiệm điều kiện. [Nhà nghiên cứu năm 2009; 1 (4): 56-61]. (ISSN: 1553-9865). Từ khóa: Phyllanthus urinaria Linn., Euphorbiaceae, Clonal tuyên truyền, acclimatization. Giới thiệu Chi Phyllanthus Linn. (Họ Euphorbiaceae) có khoảng 550 đến 750 loài và một vài người trong số họ sản xuất chất chuyển hóa Trung học hữu ích đã được chiết xuất từ toàn bộ cây (Unander năm 1996). Các thân cây, truyền của lá và rễ của Phyllanthus spp được sử dụng trong y học dân gian để điều trị nhiễm trùng đường ruột, bệnh tiểu đường, virus viêm gan siêu vi B và các rối loạn thận và bàng quang tiết niệu (Calixto và ctv., 1998). Một số hợp chất chẳng hạn như ancaloit, tannins, flavonoid, Lignan, phenol và tecpen đã được cô lập và được xác định trong nhiều loài Phyllanthus và đã cho thấy antinociceptive hành động trong con chuột và các hoạt động trị liệu (Cechinel Filho et al., 1996). Tác dụng chống vi-rút chống vi rút viêm gan siêu vi B và có thể chống lại ngược trong retroviruses cũng đã được báo cáo (Venkateswaran et al., 1987, Thyagarajan et al., 1988, Shead et al., 1992). Dược nghiên cứu thực hiện với callus chiết xuất của P. niruri, P. tenellus và P. urinaria có hiển thị các thuộc tính antinociceptive và các hợp chất chính được xác định trong các chất chiết xuất là flavonoid, tannins và phenol (Santos và ctv., 1994). Các nghiên cứu bổ sung về callus và gốc chất chiết xuất từ các loài khác nhau đã chỉ ra sự hiện diện của phyllemblin, một tanin có hoạt động kháng khuẩn của có thể hydrolyzable tanin mà ức chế DNA polymerase và ngược của geraniin và các dẫn xuất của nó cho thấy hoạt động cao ở inhibitions của HIV reverse transcriptase và enzyme chuyển đổi angiotensin tham gia vào các biến chứng bệnh tiểu đường (Ueno et al., 1988Ogata et al., 1992, Unander năm 1996). Gallotannin corilagin, axit ellagic đờm, cũng như bảy ellagitannins, đã được chứng minh là hoạt động chống lại vi-rút Epstein-Barr DNA polymerase ở cấp độ vi-molar (lưu và ctv., 1999), đã được phân lập từ Phyllanthus urinaria Linn. Hai hợp chất phenolic mới, cụ thể là methyl brevifolin carboxylate và trimethyl ester dihydrochebulic axit, cũng được cô lập từ cùng một nguồn (Yao và Zuo, 1993). Corilagin đã được báo cáo để hiển thị bioactivity trong nhiều lĩnh vực khác nhau của điều trị chẳng hạn như huyết mạch (Lin et al., 1993; Cheng et al., 1995) và chống vi-rút bệnh truyền nhiễm (Yoon và ctv., 2000). Do đó, mục đích của công việc hiện tại là thiết lập phù hợp micropropagation, cho P. urinaria Linn. cho quy mô lớn nhân đã chọn kiểu gen và để khám phá tiềm năng của họ cho nghiên cứu chất chuyển hóa thứ cấp. Vật liệu và phương pháp Đấu thầu cành cây được thu thập từ lĩnh vực phát triển cây trưởng thành của P. urinaria L. defoliated và sectioned vào 2-3 nút phân đoạn. Họ đã được rửa sạch theo các nhấp nháy liên tục chạy vòi nước trong 30 phút và sau đó được điều trị với một giải pháp của Savlon (5% v/v) cho 10 phút và cuối cùng là tiệt trùng với HgCl2 bề mặt (0,1% w/v) cho 5-10 phút cuối cùng, các tài liệu được rửa sạch 3 -5 lần với autoclaved nước cất để loại bỏ bất kỳ dấu vết của HgCl2. Chụp Mẹo và phân đoạn nút excised từ vật chất khử và phân thành miếng 1.0-1,5 cm với ít nhất một nút trong mỗi explants. Các phương tiện cơ sở được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm là xây dựng MS (Murashige và Skoog 1962) có chứa 3% Sucroza, 6-8% agar và bổ sung với BA và KN, hoặc riêng lẻ hoặc trong các kết hợp khác nhau với auxins, IBA, NAA và IAA. Các phương tiện truyền thông đã được điều chỉnh để pH 5.7 ± 0,2 và autoclaved tại 1,1 kg/cm2 cho 20 phút tại 121° C. Nền văn hóa đã được ủ tại 25 ± 1° C với một photoperiod 16 h tại 2000-3000 lux mát ánh sáng trắng huỳnh quang. Nền văn hóa đã được khởi xướng vào ống kính 150-25 mm và subcultured thường xuyên trên phương tiện truyền thông tươi tại khoảng thời gian bốn tuần trong 100 ml bình. Những cành proliferated từ chính explants đã bị cô lập và subcultured ngày tươi vừa nhiều lần cho bulking lên bắn văn hóa tài liệu. Cành (3-4 cm) đã excised từ nền văn hóa phổ biến và cấy vào một nửa sức mạnh MS bổ sung với một trong hai IBA, NAA và IAA (0,1 - 1.0 μm) cho rễ. Bắt nguồn từ bắn được chuyển cho chậu dưới cũ ống nghiệm điều kiện sau khi làm cứng thích hợp. Kết quả và thảo luận Nách bắn cảm ứng, phép nhân và rễ, những ảnh hưởng của cytokinins và auxins morphogenesis của nút phân đoạn explants được trình bày trong bảng 1, và 2. Những ảnh hưởng của cytokinins và auxins ở các nồng độ khác nhau vào nách bắn cảm ứng từ nút explants được trình bày trong bảng 1. Cytokinins đã không quảng bá chuyên sâu bắn nhân và hoặc là không có hiệu lực hoặc ức chế đáng kể số lượng các nút, bắn chiều dài và văn hóa tươi khối lượng so với các điều khiển (bảng 1). Gia tăng hiệu quả của nút explants từ cây trưởng thành đáng kể cao hơn rằng của chụp Mẹo explants khi đánh giá hai mươi ngày sau khi gia tăng. Như là một bổ sung, 1.0 μm BA cho thấy hiệu suất tốt nhất của sự gia tăng sản xuất bắn ở 100% của văn hóa explants. Explants sản xuất nhiều nhất 2.85 ± 0,10 bắn một nền văn hóa trên các phương tiện với 5.97 ± 0,13 cm chiều dài trung bình của bắn một văn hóa (Figs. B - D). Khi các explants được nuôi cấy trên phương tiện KN dựa, chỉ 47-73% số họ proliferated. Trong điều trị này, con số cao nhất của bắn mỗi explants và là bắn dài đã có 5,23 ± 0,24 và 4,60 ± 0,35 cm cho nút explants, tương ứng. Đây là những nỗ lực đầu tiên để thiết lập shoot nền văn hóa của loài này và các kết quả thu được cho thấy rằng những ảnh hưởng promotive bất thường của IBA về sự phát triển văn hóa bắn không chỉ do sự gia tăng trong nách bắn phổ biến mà còn trong số các chồi nách lá mọc thành lập trong các cành có thể được sử dụng như bắt đầu từ nguyên liệu thực vật cho thêm nhân. Kết quả tương tự đã được cho Leptadenia reticulata bắn nền văn hóa, nơi IBA, NAA và IAA kích thích đáng kể số lượng các nút cho plantlet so với cytokinins (Kalidass và ctv., 2008).Tuy nhiên, đối với các loài Phyllanthus khác, chẳng hạn như P. tenellus, P. niruri, P. caroliniensis và P. fraternus (năm 1999 Catapan, Saradhi và Islamia 1997) và cho các loài họ Đại kích khác, chẳng hạn như Excoecaria agallocha L. (Rao và ctv., 1998) cytokinins kích thích bắn phổ biến vũ khí. Hình thành gốc đã gây ra trong các cành tái sinh trong ống nghiệm bởi nuôi chúng trên một nửa sức mạnh của MS với 0.1 - μm 4.0 hoặc IBA, NAA và IAA. Trong số ba loại auxin, IBA được tìm thấy có hiệu quả nhất ở nồng độ khác nhau được thử nghiệm cho sản xuất gốc trên rìa cắt của bắn (bảng 2). Trong số các nồng độ khác nhau, 2.0 μm IBA được tìm thấy là tốt nhất cho thích hợp rễ trong đó 100% bắn bắt nguồn từ trong vòng ba tuần văn hóa (hình D). Những phát hiện này là trong thỏa thuận với những quan sát thấy trong các thực vật loài ngành nodfolia, Leptadenia reticulata (Bhatt và ctv., 2006) và Lins culinaris Medik (Omran và ctv., 2008). Các nhà máy có nguồn gốc trong ống nghiệm acclimated tốt hơn dưới cũ ống nghiệm điều kiện khi họ được chuyển vào đặc biệt tạo nhựa khay chứa coco-than bùn như potting trộn và ẩm thống nhất lúc khoảng định kỳ chăm sóc đặc biệt không để thiệt hại rễ. Phần còn lại của thủ tục, theo sau từ giai đoạn này lên đến của họ thành lập trong đất như bình thường. Khoảng 80-90% của regenerated plantlets có thể chịu đựng được và tồn tại dưới cũ ống nghiệm môi trường hoặc lĩnh vực điều kiện. Một số plantlets bị mất do dao off và hoại tử trong acclimatization trong ex ống nghiệm điều kiện. Mất regenerants do những triệu chứng cũng quan sát thấy trong bạch đàn tereticornis (Gill et al., 1993), Solanum nigrum (Ara et al., 1993), Rauvolfia serpentina (Ilahi 1993) và Rosa damascena (Kumar và ctv., 1995). Thông qua nghiên cứu này một giao thức cho tái sinh của plantlets hoàn thành đã được thành lập. Điều này có lẽ là báo cáo đầu tiên về thực vật trong ống nghiệm tái sinh của Phyllanthus urinaria Linn. Các kết quả có thể của một số tầm quan trọng như một nghiên cứu tiên phong về mô nền văn hóa của cây thuốc này.

Kết quả (Việt) 2:

Trong ống nghiệm nhân giống vô tính nhanh của Phyllanthus urinaria Linn. (Euphorbiaceae) - Một dược liệu
thực vật Kalidass C *, và Mohan VR Ethnopharmacology đơn vị, Ban nghiên cứu thực vật học, VOChidambaram College, Tutuicorin-8. * Tác giả e-mail: [e-mail] Tóm tắt: Một giao thức vi nhân hiệu quả đã được phát triển cho các cây thuốc Phyllanthus urinaria Linn. (Euphorbiaceae) sử dụng phân đoạn nút cho sự tăng sinh chồi nách. Giá nhân tối đa đã đạt được trên Ms Truyền thông bổ sung với 1,0 mM BA. Rễ đã đạt được với 100% của các chồi vi trong môi trường MS có 2,0 mM IBA. Cây tái sinh đã được di thực thành công và khoảng 80-90% của cây con sống sót dưới ex vitro điều kiện. [Nhà nghiên cứu. 2009; 1 (4): 56-61]. (ISSN: 1553-9865). Từ khóa:. Phyllanthus urinaria Linn, Euphorbiaceae, tuyên truyền dòng vô tính, quen với khí hậu. Giới thiệu Các chi Phyllanthus Linn. (Euphorbiaceae) có từ 550-750 loài và một số trong số họ sản xuất ra các chất chuyển hóa thứ hữu ích đã được chiết xuất từ toàn bộ cây (Unander 1996). Thân cây, truyền lá và rễ của Phyllanthus spp được sử dụng trong y học dân gian để điều trị nhiễm trùng đường ruột, bệnh tiểu đường, viêm gan B và rối loạn của thận và bàng quang tiết niệu (Calixto et al., 1998). Một số hợp chất như alkaloid, tannin, flavonoid, lignans, phenol và tecpen đã được phân lập và xác định các loài khác nhau của Phyllanthus và đã thể hiện hành động antinociceptive ở chuột và các hoạt động trị liệu khác (Cechinel Filho et al., 1996). Tác dụng kháng virus chống lại vi rút viêm gan B và có thể chống lại sự sao chép ngược của retrovirus cũng đã được báo cáo (Venkateswaran et al., 1987, Thyagarajan et al., 1988, Shead et al., 1992). Các nghiên cứu dược lý thực hiện với chiết xuất mô sẹo của P. niruri, P. tenellus và P. urinaria đã cho thấy tính chất antinociceptive và các hợp chất chính được xác định trong các đoạn trích là flavonoid, tannin và phenol (Santos et al., 1994). Nghiên cứu bổ sung vào mô sẹo và rễ chiết xuất của các loài khác nhau đã cho thấy sự hiện diện của phyllemblin, một tannin có hoạt tính kháng khuẩn, tannin thủy phân có thể ức chế hoạt polymerase DNA và men sao chép ngược, và các dẫn xuất của geraniin của nó cho thấy hoạt động cao trong sự kiềm chế của transcriptase ngược HIV và thuốc ức chế men chuyển đổi liên quan đến các biến chứng bệnh tiểu đường (Ueno et al 1988.,, Ogata et al., 1992, Unander 1996). Các corilagin gallotannin, acid ellagic cầm máu, cũng như bảy ellagitannins, đã được chứng minh khả năng chống lại Epstein-Barr DNA vi rút polymerase ở cấp vi mô-mol (Liu et al 1999.,), đã được phân lập từ Phyllanthus urinaria Linn. Hai hợp chất phenolic mới, cụ thể là methyl brevifolin carboxylate và trimethyl este axit dihydrochebulic, cũng đã được phân lập từ cùng một nguồn (Yao và Zuo, 1993). Corilagin đã được báo cáo cho thấy hoạt tính sinh học khác nhau trong lĩnh vực điều trị khác nhau như bệnh tim mạch chống tăng huyết áp (Lin et al, 1993;. Cheng et al., 1995) và kháng virus bệnh truyền nhiễm (Yoon et al., 2000). Vì vậy, mục đích của công việc hiện tại là thiết lập vi nhân phù hợp, cho P. urinaria Linn. . cho phép nhân quy mô lớn của các kiểu gen được lựa chọn và để khám phá tiềm năng của họ để nghiên cứu chất chuyển hóa trung học Vật liệu và phương pháp đấu thầu cành cây đã được thu thập từ các lĩnh vực trồng cây trưởng thành của P. urinaria L. rụng lá và phân thành 2-3 đoạn nút. Họ đã được rửa sạch dưới nhấp nháy liên tục chạy nước máy trong 30 phút và sau đó được xử lý bằng một giải pháp của Savlon (5% v / v) trong 10 phút và cuối cùng đã khử trùng bề mặt với HgCl2 (0,1% w / v) trong vòng 5-10 phút . Cuối cùng, các tài liệu đã được rửa 3 -5 lần với nước cất để loại bỏ bất kỳ hấp dấu vết của HgCl2. Những mẹo chụp và đoạn nút được cắt ra từ các vật liệu khử trùng và chia thành 1,0 - 1,5 cm miếng với ít nhất một nút trong mỗi cấy. Các phương tiện cơ bản được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm đã được MS (Murashige và Skoog 1962) xây dựng có chứa 3% sucrose, 6 - 8% agar có bổ sung BA và KN, riêng lẻ hoặc kết hợp khác nhau với auxin, IBA, NAA và IAA. Các phương tiện truyền thông đã được điều chỉnh để pH 5,7 ± 0,2 và hấp ở mức 1,1 kg / cm2 trong 20 phút ở 121 ° C. Văn hóa được ủ ở 25 ± 1 ° C với một gian chiếu sáng 16 h tại 2.000-3.000 lux của ánh sáng huỳnh quang trắng lạnh. Nền văn hóa đã được khởi xướng vào năm 150-25 ống kính mm và cấy truyền thường xuyên trên môi trường mới trong khoảng thời gian bốn tuần trong 100 ml bình. Các chồi mà sinh sôi nẩy nở từ cấy tiểu học được phân lập và nuôi cấy trên môi trường nhiều lần trong lành cho bulking lên chất liệu văn hóa shoot. Măng (3-4 cm) được cắt từ các nền văn hóa phát triển hạt nhân và cấy trên nửa sức mạnh MS có bổ sung một trong IBA, NAA và IAA (0,1-1,0 mM) cho rễ. Bắt nguồn từ măng đã được chuyển giao cho chậu dưới ex vitro điều kiện sau khi làm cứng thích hợp. Kết quả và thảo luận nách chụp cảm ứng, nhân và rễ, những tác động của cytokinin và auxin trên hình thái của cấy phân khúc nút được thể hiện trong Bảng 1 và 2. Những tác động của cytokinin và auxin ở nồng độ khác nhau trên shoot nách cảm ứng từ cấy nút được trình bày trong bảng 1. cytokinin đã không thúc đẩy nhân shoot chuyên sâu và hoặc không có ảnh hưởng hoặc bị ức chế đáng kể số lượng các nút, bắn dài và nền văn hóa đại chúng tươi so với các điều khiển ( Bảng 1). Hiệu quả phát triển của các mối cấy từ cây trưởng thành cao hơn so với các shoot cấy tip đáng kể khi đánh giá hai mươi ngày sau khi phổ biến. Là một bổ sung, 1.0 mM BA cho thấy hiệu suất tốt nhất của sự phát triển đó được sản xuất măng ở 100% của cấy nuôi. Cấy sản xuất số lượng cao nhất 2,85 ± 0,10 chồi mỗi nền văn hóa trên trung bình với 5,97 ± 0,13 cm chiều dài trung bình của chồi mỗi nền văn hóa (hình B -. D). Khi cấy được cấy trên KN dựa trung bình, chỉ 47-73% trong số họ sinh sôi nẩy nở. Trong phương pháp này, số lượng cao nhất của mỗi chồi cấy và độ dài trung bình là 5,23 shoot ± 0,24 và 4,60 ± 0,35 cm cho cấy nút tương ứng. Đây là những nỗ lực đầu tiên để thiết lập nền văn hóa shoot của loài này và kết quả thu được cho thấy những bất thường tác dụng nâng cao sức của IBA đến sự phát triển văn hóa shoot không chỉ nhờ vào sự gia tăng phổ biến shoot nách nhưng cũng trong số chồi nách được hình thành trong các chồi cây mà có thể được sử dụng như nguyên liệu thực vật bắt đầu cho phép nhân hơn nữa. Kết quả tương tự cũng được cho Leptadenia nền văn hóa shoot reticulata, nơi IBA, NAA và IAA kích thích đáng kể số lượng nút cho mỗi cây non so với cytokinin (Kalidass et al., 2008) .Tuy nhiên, đối với các loài Phyllanthus khác, chẳng hạn như P. tenellus, P. niruri, P. caroliniensis, và P. fraternus (Catapan 1999, Saradhi và Islamia 1997) và cho các loài Euphorbiaceae khác, chẳng hạn như Excoecaria agallocha L. (Rao et al., 1998) cytokinin kích thích sự tăng sinh shoot. hình gốc được cảm ứng trong ống nghiệm chồi tái sinh bằng nuôi cấy chúng trên một nửa sức mạnh của MS với 0,1-4,0 mM hoặc của IBA, NAA, và IAA. Trong số ba loại auxin, IBA đã được tìm thấy là có hiệu quả nhất ở các nồng độ khác nhau được thử nghiệm cho sản xuất gốc trên lề cắt của chồi (Bảng 2). Trong số các nồng độ khác nhau, 2,0 mM IBA đã được tìm thấy là tốt nhất cho rễ thích hợp, trong đó 100% chồi bén rễ trong vòng ba tuần nuôi cấy (Hình. D). Những phát hiện này trong thỏa thuận với những người quan sát thấy ở các loài cây khác phyla nodfolia, Leptadenia reticulata (Bhatt et al., 2006) và Lins culinaris Medik (Omran et al., 2008). Các loài thực vật có nguồn gốc in vitro thích nghi tốt hơn dưới ex vitro điều kiện khi chúng được chuyển vào khay nhựa làm đặc biệt có chứa dừa than bùn như potting mix và làm ẩm đều với chu kỳ thời gian chăm sóc đặc biệt không gây hại cho rễ. Phần còn lại của các thủ tục, tiếp từ giai đoạn này lên để thành lập trong đất là như bình thường. Khoảng 80 - 90% của các cây con tái sinh có thể chịu đựng được và tồn tại dưới ex vitro môi trường hoặc trường điều kiện. Một số cây con đã mất do giảm xóc tắt và hoại tử trong quá quen với khí hậu trong ex vitro điều kiện. Mất regenerants do các triệu chứng như vậy cũng đã được quan sát thấy trong Eucalyptus ®Êt n¬ng (Gill et al., 1993), Solanum nigrum (Ara et al., 1993), Ba gạc hoa đỏ (Ilahi 1993) và Rosa Damascena (Kumar et al., 1995) . Thông qua nghiên cứu này là một giao thức cho sự tái sinh của cây con hoàn chỉnh đã được thành lập. Đây có lẽ là báo cáo đầu tiên trên in vitro cây tái sinh của Phyllanthus urinaria Linn. Các kết quả có thể là của một số quan trọng như một nghiên cứu tiên phong về nuôi cấy mô của cây thuốc này.